Abstract

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Studiu clinic.

Comitetul de revizuire instituțională a aprobat toate studiile (transversal, pierderea în greutate, microdializă și adipogeneza in vitro) și toți subiecții au dat consimțământul scris în prealabil. Dintr-o populație descrisă anterior (10) de femei menopauză caucaziene, am comparat femeile menopauze slabe, supraponderale și obeze într-un studiu transversal. În studiul de scădere în greutate, 30 de femei caucaziene la menopauză au început un protocol dietetic de reducere a greutății și au fost sfătuiți să reducă aportul de energie cu 600 kcal/zi, așa cum s-a descris anterior (11). Șaptesprezece femei au atins obiectivul de reducere a greutății cu 5% după 13 săptămâni și au fost incluse în analiza expresiei genei țesutului adipos și a RBP4 seric. În ambele studii, niciun participant nu a fost diabetic sau a avut boli renale sau hepatice, insuficiență cardiacă congestivă sau boli coronariene. Terapia de substituție hormonală a fost întreruptă cu 4 săptămâni înainte și toate celelalte medicamente cu o săptămână înainte de studii. Participanții nu și-au schimbat greutatea corporală cu> 1 kg în cele 3 luni înainte de începerea studiului. Măsurătorile antropometrice și probele de sânge au fost obținute la 9:00 a.m. în urma unui post peste noapte. Țesutul adipos subcutanat periumbilical a fost obținut prin biopsie cu ac așa cum s-a descris anterior (10,11).

leagă

Studiu de microdializă.

Studiu de adipogeneză in vitro.

Țesutul adipos subcutanat mamar a fost obținut de la femeile sănătoase (IMC 25-30 kg/m 2, cu vârsta cuprinsă între 35-58 ani) prin intervenție chirurgicală de reducere a sânilor pentru izolarea celulelor adipoase umane. Celulele stromavasculare și adipocitele mature au fost izolate prin digestia colagenazei și cultivate peste noapte în mediu conținând ser, așa cum s-a descris anterior (13). ARN total a fost izolat din probe pereche de celule stromavasculare și adipocite mature de la fiecare donator după o zi suplimentară de cultură în condiții fără ser pentru a compara expresia genei RBP4. Adipogeneza în celulele stromavasculare a fost indusă de un cocktail de insulină, izobutilmetilxantină, cortizol și triiodotironină așa cum s-a descris anterior (13). Secreția RBP4 în mediul de cultură a fost comparată între celulele stromavasculare și adipocitele diferențiate în ziua 12 după inducerea adipogenezei.

metode de analiză.

ARN-ul total din preadipocite, adipocite și biopsii de țesut adipos a fost izolat folosind mini-kitul Qiagen RNeasy (inclusiv setul de DNază fără RNază; Qiagen, Hilden, Germania). Expresia genei RBP4 și GLUT4 au fost determinate cu sistemul de detectare a secvenței ABI 5700 pentru PCR în timp real (PE Biosystems, Weiterstadt, Germania) prin metoda curbei standard și normalizate prin controale endogene, rezultând unități arbitrare (AU) (13). Au fost utilizate teste premixate la cerere pentru RBP4, GLUT4, gliceraldehidă-3 fosfat dehidrogenază umană (GAPDH) și ARNr 18S (PE Biosystems, Weiterstadt, Germania) care conțin grunduri premixate și sonde marcate fluorescent. Coeficienții de variație între teste (CV) pentru GAPDH (1,1%), 18S rARN (0,9%), RBP4 (1,3%) și GLUT4 (1,4%) au fost determinați utilizând un ADNc standardizat de țesut adipos uman din laboratorul nostru.

RBP4 în probele de ser a fost măsurat prin analiza competitivă imunosorbentă legată de enzime (ELISA) (AdipoGen, Seoul, Coreea) folosind metoda curbei standard cu o serie de diluare a unui eșantion RBP4 uman furnizat (R 2 = 0,99 pentru regresia liniară a curbei standard ). CV-ul între teste (măsurat printr-un control furnizat de producător cu fiecare placă) a fost de 8,4%; CV intra-test (măsurarea a șase probe de ser identice pe fiecare placă) a fost de 5,3%.

Lipidele din sânge, glucoza și insulina au fost măsurate de un laborator certificat. Modificările fluxului sanguin au fost determinate folosind tehnica de diluare a etanolului și principiul lui Fick. O scădere a raportului flux-intrare (raport etanol) este echivalentă cu o creștere a fluxului sanguin și invers. Etanolul a fost măsurat cu un test enzimatic standard (14). Concentrațiile de glucoză și lactat din dializat au fost măsurate cu ajutorul analizorului CMA/600 (CMA Microdialysis). Recuperarea in situ a glucozei și lactatului în dializatele țesutului adipos a fost de -30% (12).