Juan Zhou

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Elliot D. Mock

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Andrea Martella

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Vasudev Kantae

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

‡ Departamentul de Bioștiințe Analitice și Metabolomică, Centrul Academic Leiden pentru Cercetarea Medicamentelor, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Xinyu Di

‡ Departamentul de Bioștiințe Analitice și Metabolomică, Centrul Academic Leiden pentru Cercetarea Medicamentelor, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Lindsey Burggraaff

§ Departamentul de descoperire computerizată a medicamentelor, Centrul Academic de Cercetare a Medicamentelor din Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Marc P. Baggelaar

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Karol Al-Ayed

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Alexander Bakker

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Bogdan I. Florea

∥ Departamentul de sinteză bio-organică, Institutul de chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Sebastian H. Grimm

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Hans den Dulk

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Chun T. Li

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Laura Mulder

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Herman S. Overkleeft

∥ Departamentul de sinteză bio-organică, Institutul de chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Thomas Hankemeier

‡ Departamentul de Bioștiințe Analitice și Metabolomică, Centrul Academic Leiden pentru Cercetarea Medicamentelor, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Gerard J. P. van Westen

§ Departamentul pentru descoperirea computațională a medicamentelor, Centrul Academic de Cercetare a Medicamentelor din Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Mario van der Stelt

† Departamentul de Fiziologie Moleculară, Institutul de Chimie Leiden, Universitatea Leiden, Leiden, Olanda

Date asociate

Abstract

activitate

Fosfolipaza A2, grupa XVI (PLA2G16) este o tiolhidrolază din familia HRASLS care reglează lipoliza în țesutul adipos și a fost identificată ca un factor gazdă care permite intrarea celulară a picornavirusurilor. Instrumentele chimice sunt esențiale pentru vizualizarea și controlul activității PLA2G16, dar nu au fost raportate până în prezent. Aici, arătăm că MB064, care este o sondă de lipază fluorescentă, etichetează, de asemenea, PLA2G16 recombinant și exprimat endogen. Profilarea proteinelor bazate pe activitate competitivă (ABPP) folosind MB064 a permis descoperirea a-cetoamidelor ca primii inhibitori selectivi ai PLA2G16. LEI110 a fost identificat ca un puternic inhibitor PLA2G16 (Ki = 20 nM) care reduce nivelurile de acid celular arahidonic și lipoliza indusă de acid oleic în celulele HepG2 umane. ABPP pe bază de gel și proteomica chimică au arătat că LEI110 este un pan-inhibitor selectiv al familiei HRASLS de hidrolaze tiol (adică PLA2G16, HRASLS2, RARRES3 și iNAT). Simulările dinamice moleculare ale LEI110 în structura cristalină raportată a PLA2G16 au oferit o perspectivă asupra interacțiunilor potențiale ligand - proteine ​​pentru a explica modul său de legare. În concluzie, am dezvoltat primul inhibitor selectiv care poate fi utilizat pentru a studia rolul celular al PLA2G16.

Fosfolipaza A2, grupa XVI (PLA2G16), a fost izolată pentru prima dată în fibroblastele murine ca produs al familiei genelor HRASLS, care include și fosfolipaza/aciltransferazele, și anume, enzima metabolizantă a fosfolipidelor A-C1 (A-C1), supresor de tip HRAS 2 (HRASLS2), proteina care răspunde la receptorul acidului retinoid 3 (RARRES3) și N-aciltransferaza independentă de Ca2+ (iNAT). 1−3 PLA2G16 este o tiolhidrolază transmembranară intercelulară, cu o singură trecere, cu o greutate moleculară de 18 kDa care hidrolizează predominant lanțul acil gras sn-2 al fosfatidilcolinei. 4,5 PLA2G16 are un motiv pliabil al papainei format din trei α-helici și cinci foi β antiparalel organizate într-o permutare circulară și o triadă catalitică conservată formată din Cys113, His23 și His35, determinate de cristalografia cu raze X (PDB) cod: 4DOT) și studii de mutageneză direcționate către sit. 6-9

PLA2G16 se găsește în diferite linii celulare (de exemplu, HepG2) 10.11 și țesut adipos. 12.13 Expresia sa este indusă în timpul diferențierii adipocitelor. 14,15 PLA2G16 reglează lipoliza, iar ablația sa genetică a împiedicat obezitatea la șoareci indusă de o dietă bogată în grăsimi sau de deficit de leptină. 16 Recent, PLA2G16 a fost identificat ca un factor gazdă pentru picornavirusuri, care cauzează răceala comună, facilitând translocarea genomului viral și prevenind eliminarea virusului în celulele gazdă. 17.18 Luate împreună, aceste studii genetice evidențiază potențialul terapeutic al PLA2G16. Cu toate acestea, până în prezent, nu sunt raportați inhibitori ai PLA2G16 care să poată fi folosiți ca instrumente farmacologice pentru validarea PLA2G16 ca țintă terapeutică.

Profilarea pe bază de activități a proteinelor (ABPP) este o tehnică biologică chimică puternică care permite studii eficiente de descoperire a plumbului prin evaluarea activității inhibitorilor și selectivității în proteomi nativi complecși. 19.20 ABPP folosește sonde chimice care reacționează covalent cu aminoacidul catalitic într-o manieră dependentă de activitate. Sonda bazată pe activitate (ABP) conține un focos legat de un indicator de fluorofor sau biotină pentru detectarea pe bază de fluorescență sau respectiv de spectrometrie de masă. În prezent, nu au fost raportate ABP pentru PLA2G16 care ar putea permite descoperirea inhibitorilor.

Anterior, am dezvoltat și aplicat sonda pe bază de β-lactonă (MB064) ca sondă cu spectru larg pentru identificarea inhibitorilor diacilglicerol lipazei puternic și selectivi. 21,22 În plus, MB064 a avut un rol esențial în descoperirea profilului off-target al inhibitorului acidului gras amidhidrolază BIA 10-2474 care a cauzat moartea unui voluntar într-un studiu clinic de fază 1. 23 β-lactona este un focos care reacționează covalent cu serina catalitică în multe serine hidrolaze, formând un intermediar enzimatic acil. În mod interesant, MB064 a fost, de asemenea, raportat pentru a forma legături tioester cu cisteina catalitică a diferitelor enzime. 24 Aici, raportăm că MB064 etichetează PLA2G16 într-o manieră dependentă de activitate și este capabil să vizualizeze PLA2G16 endogen în țesutul adipos. Screeningul unei biblioteci concentrate de inhibitori de lipază utilizând ABPP și optimizarea ulterioară a rezultatului a dus la identificarea α-cetoamidei LEI110 ca inhibitor selectiv PLA2G16 care reduce nivelurile de acid celular arahidonic și lipoliza indusă de acid oleic în celulele HepG2 umane.

Caracterizarea MB064 ca ABP pentru PLA2G16. (A) Structura chimică a sondei MB064. (B) ABPP utilizând MB064 cu membrană PLA2G16 (mem) sau proteom citosol (cyt) (1 mg ml-1) exprimat tranzitoriu în celule HEK293T și Western blot al gelului ABPP folosind un anticorp anti-FLAG. (C) Optimizarea stării ABPP pentru proteomul citosolului PLA2G16 uman folosind MB064. Pentru testul concentrației sondei, s-a utilizat 0,5 mg mL - 1 lizat proteic. Pentru testul concentrației de proteine, a fost utilizată o sondă de 500 nM. (D) ABPP folosind MB064 cu diferite construcții hPLA2G16 și Western blot al gelului ABPP folosind un anticorp anti-FLAG. (E) Etichetarea PLA2G16 endogen în proteomul citosolului WAT și BAT de către MB064 și Western blot al gelului ABPP folosind un anticorp anti-PLA2G16 (gelurile complete sunt date în SI).

Descoperirea și caracterizarea biochimică a compusului 1. (A) Structura chimică a 1. (B) Doza - curbele de răspuns pentru 1 pe PLA2G16 (stânga) și alți membri HRASLS, HRASLS2, RARRES3 și iNAT (dreapta) măsurată prin ABPP competitiv folosind proteom citosol preparat din celule HEK293T transfectate cu sonda MB064. Sub curbe sunt gelurile ABPP corespunzătoare: inhibarea dependentă de concentrație a 1 împotriva diferitelor proteine ​​(n = 3). (C) Doza - curba de răspuns a 1 pentru PLA2G16 (proteom citosol preparat din PLA2G16 supraexprimând celule HEK293T) cu testul substratului fluorescent PC-A2 (n = 3). (D) Selectivitatea 1 împotriva MB064 și FP-TAMRA în membrana creierului șoarecelui (mem) și proteos citosol (cyt). Coomassie a fost utilizat ca control al încărcării proteinelor. Semnul minus (-) indică controlul (cu DMSO), semnul plus (+) indică cu 1 la 10 μM.

Compus 1 a fost resintetizat utilizând proceduri raportate anterior (a se vedea secțiunea Materiale și metode) și testat într-un test ABPP de concentrație-răspuns. Compus 1 a afișat o concentrație inhibitoare jumătate maximă (pIC50 ± SEM) de 6,0 ± 0,1 (n = 3) (Figura Figura 2 2 B). Mai mult, a demonstrat activitate similară pe celelalte proteine ​​din familia genelor HRASLS (HRASLS2, RARRES3 și iNAT) cu un pIC50 în intervalul 6.0-6.2 (Figura Figura 3 3 B, Tabelul 1). Apoi, am confirmat activitatea inhibitoare a compusului 1 într-un test de fluorescență biochimică ortogonală raportat anterior care utilizează Green/Red Bodipy PC-A2 ca substrat surogat (cu un KM de 7,8 ± 2,2 μM) și citosol PLA2G16 fracțiune de celule HEK293T supraexprimând PLA2G16 uman. 8 Compus 1 a afișat o valoare Ki de 84 nM (interval de încredere 95% CI: 72-96 nM) (Figura Figura2 2 C). S-a raportat anterior că α-cetoamidele inhibă serina hidrolazele exprimate în creier. 26−29 Pentru a determina selectivitatea compusului 1 pe serine hidrolaze exprimate endogen, am efectuat un experiment competitiv ABPP în proteomi creierului șoarecelui folosind serp hidrolaza cu spectru larg ABP, fluorofosfonat (FP) -TAMRA și MB064. Compus 1 (10 μM) nu a redus etichetarea oricăror proteine ​​din creierul șoarecilor vizate de FP-TAMRA sau MB064 (Figura Figura 2 2 D). Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că α-cetoamida 1 este un inhibitor selectiv al PLA2G16 și al membrilor familiei sale.

În cele din urmă, pentru a obține o perspectivă asupra interacțiunilor moleculare ale α-cetoamidelor cu PLA2G16, LEI110 și 1 au fost andocate într-o structură cristalină PLA2G16 (PDB: 4DOT). 6 Am imaginat că cetona electrofilă a LEI110 și 1 ar putea acționa printr-un mecanism covalent reversibil cu situsul activ Cys113 formând un aduct hemitioacetal, similar cu alți inhibitori de α-cetoamidă raportați. 34 LEI110 și 1 au fost astfel atașați covalent la Cys113 în enzimă și s-a efectuat o simulare a dinamicii moleculare (Figura Figura 3 I). Legătura de hidrogen a oxianionului cu His23 a fost observată în ambele cazuri, precum și stivuirea π - π cu Tyr21. Extinderea lanțului cetonic alchilic cu un metilen permite o interacțiune mai optimă a cationului π cu Arg18 pentru LEI110, comparativ cu 1. Mai mult, introducerea fragmentului piridil în LEI110 permite o legătură suplimentară de hidrogen cu Tyr21-OH. Aceste rezultate de andocare oferă o explicație potențială pentru creșterea de 10 ori a activității observată pentru LEI110.

În concluzie, am aplicat ABPP competitiv folosind MB064 pentru a detecta a-cetoamidele ca primii inhibitori selectivi ai PLA2G16. LEI110 a fost identificat ca un puternic inhibitor PLA2G16 (Ki = 20 nM) care reduce nivelurile de acid celular arahidonic în celulele U2OS care supraexprimă PLA2G16 și steatoza indusă de acid oleic în celulele HepG2 umane. ABPP pe bază de gel și proteomica chimică au arătat că LEI110 este un pan-inhibitor selectiv al familiei HRASLS a hidrolazelor tiolului (adică HRASLS2, RARRES3 și iNAT). Simulările dinamice moleculare ale LEI110 în structura cristalină raportată a PLA2G16 au oferit o perspectivă asupra interacțiunilor potențiale ligand - proteine ​​pentru a explica modul său de legare. α-cetoamidele au fost utilizate anterior ca focoase pentru inhibarea hidrolazelor 35-37 și sunt încorporate în medicamentele comercializate pentru tratamentul infecției virale cu hepatita C (de exemplu, boceprevir); 38,39, prin urmare, se anticipează că LEI110 constituie un punct de plecare excelent pentru dezvoltarea de medicamente bazate pe structură a unor noi terapii moleculare pentru obezitate și/sau răceala obișnuită.

Metode

Toate metodele sunt descrise în Informațiile de sprijin.

Mulțumiri

Mulțumim Consiliului chinez de burse (JZ, subvenția nr. 201207060003) pentru sprijin financiar. Mulțumim lui N. Ueda pentru că a oferit cu amabilitate plasmidele familiei HRASLS. Recunoaștem ChemAxon pentru că a oferit cu amabilitate software-ul Instant JChem pentru a gestiona biblioteca noastră compusă.

Informații suport disponibile

Informațiile de sprijin sunt disponibile gratuit pe site-ul ACS Publications la DOI: 10.1021/acschembio.8b00969.

Proceduri experimentale, figuri suport, tabele suport și caracterizarea compusului (PDF)

Set de date al proteinelor identificate în celulele HepG2, BAT și WAT (XLSX)

Note

Autorii nu declară niciun interes financiar concurent.