Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia === Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia

UN. Institutul de compuși organoelementali Nesmeyanov, Academia Rusă de Științe, str. Vavilov, 28, 119991 Moscova, Rusia

UN. Institutul de compuși organoelementali Nesmeyanov, Academia Rusă de Științe, str. Vavilov, 28, 119991 Moscova, Rusia

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia === Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia

Departamentul de Enzimologie Chimică, Facultatea de Chimie, M.V. Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova, Dealurile lui Lenin, 1/11, 119992 Moscova, Rusia

UN. Institutul de compuși organoelementali Nesmeyanov, Academia Rusă de Științe, str. Vavilov, 28, 119991 Moscova, Rusia

UN. Institutul de compuși organoelementali Nesmeyanov, Academia Rusă de Științe, str. Vavilov, 28, 119991 Moscova, Rusia

Prezentat parțial la reuniunea COST privind Bioincapsularea (Belgrad, iunie 2004)

Abstract

INTRODUCERE

În prezent, producția de acid lactic (LA), care este utilizat pe scară largă în diverse zone, continuă să crească. 1 În acest sens, sunt de interes deosebit noile abordări biotehnologice ale intensificării producției de LA, precum și căutarea de noi producători microbieni. Diferite tulpini bacteriene au fost utilizate pentru fermentarea LA, dar toate necesită medii nutritive bogate, cu valori ale pH-ului de cel puțin 5,5. În aceste condiții, apare creșterea celulelor; prin urmare, o mare parte a nutrienților este consumată pentru acumularea de biomasă celulară și nu pentru sinteza produsului. Astfel, concentrația finală a produsului țintă (și anume LA) este mai mică decât se poate obține în absența creșterii celulare. Pe de altă parte, implementarea ciupercilor în locul bacteriilor ca producători de LA este foarte atractivă, 3 deoarece ciupercile sunt rezistente la concentrații mari de LA acumulată. 4, 5 De asemenea, contrar bacteriilor, care produc amestecuri racemice de forme D (-) și L (+) - LA, ciupercile permit producerea de L (+) - LA practic pur.

MATERIALE ȘI METODE

Amidonul de cartof (cel mai înalt grad) și PVA (marca comercială 16/1) utilizate în lucrare au fost achiziționate de la fabrica de amidon Belinichi (Belinichi, Bielorusia) și respectiv NPO Azot (Severodonetsk, Ucraina), respectiv. Tulpina fungică Rhizopus oryzae NRRL - 395 a fost primit din Colecția Națională Rusă de Microorganisme Industriale. Sporii au fost crescuți pe mediu de dextroză 6 cu agar (2%).

Mărgele IBC cu diametrul de 1-1,5 mm au fost preparate prin prinderea R. oryzae spori în PVA - CG urmat de germinarea celulară conform procedurii brevetate. 11

Mediul cu glucoză utilizat pentru fermentarea LA a fost după cum urmează (g L -1): glucoză - până la 120, (NH4) 2SO4 - 3,0, MgSO4,7H2O - 0,3, ZnSO4,7H2O - 0,05, KH2PO4 - 0,2.

Pentru prepararea mediului pe bază de hidrolizat acid de amidon, acesta din urmă a fost lichefiat prin hidroliză acidă la 121 ° C timp de 1 oră cu neutralizare ulterioară cu hidroxid de sodiu. Cantitatea necesară de 2 mol L-1 HCI a fost de 0,5% (v/v). Hidrolizatul astfel obținut a fost analizat pentru concentrația de glucoză și îmbogățit cu următoarele săruri (g L -1): (NH4) 2SO4 - 3,02, MgSO4,7H2O - 0,25, ZnSO4,7H2O - 0,04, KH2PO4 - 0,15.

Pentru a efectua fermentația LA folosind amidon nativ ca substrat principal, amidonul de cartofi a fost gelatinizat la 70 ° C timp de 5 min. S-au adăugat aceleași săruri utilizate în experimentele cu hidrolizate de amidon pentru a prepara mediul de fermentare.

Cultivarea celulelor imobilizate a fost efectuată pe un agitator la 200 rpm, 28 ° C și pH 5,0-6,0. Margelele IBC au fost utilizate în procesele discontinue și semi-discontinue; IBC a fost spălat cu 20 mmol L-1 K/Na - tampon fosfat (pH 6,8) după fiecare ciclu discontinuu. Pentru a menține pH-ul la un nivel optim, carbonatul de calciu (5-10 g L -1), sterilizat anterior într-o formă uscată, a fost adăugat la mediul de fermentație înainte de cultivare.

Concentrația de celule imobilizate a fost calculată în conformitate cu procedura cunoscută. 4

Productivitatea procesului a fost determinată ca cantitatea de LA solubilă și precipitată care s-a acumulat în bulion pe parcursul întregului proces. Înainte de analiză, precipitatul lactatului de calciu a fost transformat în forma solubilă prin adăugare de acid sulfuric. Concentrația totală de LA a fost determinată prin HPLC (Econo System, Bio-Rad) utilizând o coloană de excludere a ionilor Aminex HPX-87H. Eluantul, 2 mmol L -1 acid benzoic, a fost utilizat la un debit de 0,7 ml min -1, iar temperatura coloanei a fost de 80 ° C. Concentrația de amidon a fost analizată prin metoda colorimetrică de iod. Concentrațiile izomerului L (+) - LA și ale glucozei au fost testate prin metode enzimatice folosind un kit L (+) - lactat oxidază - peroxidază (Sentinel, Italia) și respectiv kit glucozoxidază - peroxidază (Impact, Rusia), respectiv.

REZULTATE SI DISCUTII

Pregătirea biocatalizatorului imobilizat

Procedura de preparare a IBC pe bază de celule fungice prinse în criogel PVA a constat în două etape principale: (i) prinderea R. oryzae spori din matricea criogelului și (ii) vegetația celulelor fungice din interiorul granulelor de gel până la starea de echilibru. PVA - CG a fost ales ca purtător de imobilizare deoarece această matrice, în ciuda porozității sale ridicate (care asigură difuzia neîmpiedicată a substraturilor și a metaboliților de orice greutate moleculară), posedă proprietăți mecanice foarte bune și o sensibilitate scăzută la eroziunea abrazivă chiar și în reactoare cu agitare foarte intensă. 8-10 Mărimea macroporilor (secțiunea transversală de aproximativ 1-2 µm) și arhitectura interconectată a acestora oferă suficient spațiu pentru creșterea miceliului înglobat în gel în a doua etapă (ii) a formării IBC. Acest lucru poate fi văzut clar în Fig. 1, care prezintă o imagine SEM a unei regiuni interioare a unei mărgele IBC. Această cifră confirmă, de asemenea, că nu apar limitări în timpul creșterii celulare în ceea ce privește nutrienții și oxigenul pentru această tulpină aerobă imobilizată, deoarece s-a format miceliu bine dezvoltat.

producția

Micrografie cu microscopie electronică de scanare a suprafeței biocatalizatorului (1 - hife fungice, 2 - PVA - matrice CG).

Mărgele IBC cu un conținut de substanță uscată de 15% au fost utilizate în experimentele de fermentare ulterioare. Măsurarea variațiilor greutății mărgelelor și a conținutului de substanță uscată în timpul exploatării IBC nu a arătat nicio modificare semnificativă a acestor parametri. Prin urmare, avem motive să afirmăm că masa IBC a fost constantă în toate investigațiile noastre.

Producția de acid lactic din glucoză

Rezultatele formării LA din glucoză (120 g L -1) în procesele discontinue și semi-lot folosind IBC preparat sunt prezentate în Fig. 2 (a și respectiv b). Opt cicluri consecutive au fost efectuate în timpul procesului de batch. Durata fiecărui ciclu a fost de 25 de ore, în acest timp glucoza a fost practic epuizată. Productivitatea maximă a procesului și randamentul LA obținut în acest caz au fost de 112,7 g L -1 și respectiv 94%. Productivitatea medie calculată a procesului a fost de 5,0 ± 0,2 g L −1 h −1. Scăderea productivității pe întreaga perioadă de exploatare (200 h) a fost de aproximativ 8%.

Diagrame de timp pentru procesele în lot (a) și semi-lot (b) de fermentare a acidului lactic din glucoză catalizată de IBC (1 - glucoză, 2 - acid lactic).

Utilizarea celulelor fungice prinse PVA-CG pentru conversia mediilor care conțin glucoză au arătat că cea mai mare eficiență a procesului a fost atinsă când s-a folosit o concentrație IBC de 65 g L -1. Pe baza comparației ulterioare a producției de LA cu trei tipuri de substraturi, această concentrație de IBC a fost utilizată pe parcursul experimentelor.

Pentru a evita epuizarea completă a glucozei în mediu în timpul producției de LA, a fost utilizat procesul semi-lot, cu glucoză adăugată la fiecare 10-14 ore (Fig. 2 (b)). Carbonatul de calciu a fost introdus în mediu, transformând o parte din LA în precipitat de lactat de calciu. Astfel, excesul de ioni lactat a fost îndepărtat din mediul de cultură și procesul de echilibru a fost deplasat către sinteza produsului. Cu toate acestea, a fost observată o scădere treptată a productivității, prin urmare, după 100 de ore, cultivarea celulelor imobilizate a fost oprită în experimentele noastre. Probabil, acumularea de produs în partea solubilă a bulionului ar putea provoca inhibarea proceselor metabolice și agravarea condițiilor aerobe. Productivitatea medie calculată a unui astfel de proces semi-lot a fost de 2,8 ± 0,4 g L −1 h −1. Concentrația finală a produsului în bulion a fost ridicată și a atins 173 g L -1, iar randamentul LA, reprezentând cantitatea totală de substrat introdusă, a fost de 78%. Astfel, în comparație cu fermentația discontinuă, o anumită scădere a randamentului produsului a fost un compromis pentru o creștere considerabilă a concentrației finale de LA acumulate în timpul procesului semi-lot.

Producția de acid lactic din hidrolizați acizi de amidon

Studii similare au fost efectuate pentru transformarea hidrolizaților de amidon acid în LA folosind IBC în procesele discontinue (Fig. 3 (a)) și semi-lot (Fig. 3 (b)). Concentrația inițială de glucoză în aceste hidrolizate a fost de 110 g L -1 .

Diagramele de timp pentru procesele discontinue (a) și semi-lot (b) de fermentare a acidului lactic din hidrolizat de acid amidon catalizat de IBC (1 - glucoză, 2 - acid lactic).

Au fost efectuate șase cicluri iterative în procesul discontinuu, iar durata fiecăruia a fost de 30 de ore (Fig. 3 (a)). Productivitatea maximă a procesului și randamentul LA în acest caz au fost de 56,7 g L -1 și respectiv 52%. Productivitatea medie a procesului a fost de aproximativ 1,8 ± 0,2 g L −1 h −1. Spre deosebire de procesul efectuat cu substrat de glucoză (Fig. 2 (a)), productivitatea IBC în mediul care conține hidrolizat de amidon nu a scăzut deloc timp de 180 de ore. Mai mult, s-a observat o creștere de aproximativ 9% a productivității (comparativ cu nivelul inițial) la sfârșitul ultimului ciclu de lucru. Probabil, acesta a fost rezultatul unei mai bune adaptări a celulelor imobilizate la substratul mai complex (bogat).

Noi porțiuni de hidrolizat de amidon au fost introduse în mediu la fiecare 8-14 ore în timpul procesului semi-lot (Fig. 3 (b)). Productivitatea medie a procesului a fost de aproximativ 1,4 ± 0,3 g L −1 h −1, iar concentrația finală de LA în mediul de cultură după cultivarea 130 h a fost de 110,8 g L −1. Randamentul produsului de 45% a fost obținut în acest proces, care a reprezentat cantitatea totală de substrat principal introdus în mediu. Astfel, s-a observat o eficiență oarecum mai mică a procesului care utilizează IBC atunci când se utilizează hidrolizate de amidon acid decât atunci când se utilizează glucoză pentru producția de LA atât în ​​procesele discontinue, cât și în cele semi-discontinue.

Producția de acid lactic din amidon de cartofi

Alături de glucoză și hidrolizate de amidon acid, amidonul de cartof gelatinizat a fost examinat ca substrat pentru producerea de LA catalizat de imobilizat R. oryzae celule. Concentrațiile inițiale de amidon de la 5 până la 70 g L -1 au fost utilizate în experimente. Procesul discontinuu a fost efectuat timp de 480 ore. Durata unui singur ciclu a fost de 40 de ore și mediul a fost complet substituit cu unul nou la sfârșitul fiecărui ciclu. Creșterea concentrației inițiale de amidon până la 50 g L −1 a dus la o creștere a productivității procesului până la 0,3 g L −1 h −1, dar concentrații mai mari de polizaharide de amidon în mediul de fermentație nu au provocat o modificare semnificativă a nivel. Cu toate acestea, cea mai mare concentrație finală de LA (15 g L -1) a fost obținută când s-a folosit o concentrație de amidon de 70 g L -1. S-a constatat că atunci când procesul de formare a lotului de formare a LA catalizat de IBC a fost realizat pe o bază atât de îndelungată, a avut ca rezultat o pierdere de 10-15% a activității metabolice inițiale a celulelor. Cu toate acestea, este important ca și amidonul nehidrolizat să poată fi transformat în LA în condițiile utilizate, indicând astfel secreția enzimelor amilolitice de către ciuperca imobilizată. R. oryzae.

În plus, am arătat că noul IBC a fost capabil să producă LA, cu 98,3-99,5% în forma izomerului L (+) în toate procesele descrise mai sus.

Productivitatea procesului obținută în condiții discontinue într-un singur ciclu, când celulele fungice libere care nu cresc, au fost utilizate pentru producerea de LA din glucoză și hidrolizate de amidon acid, au fost, respectiv, cu 15% și cu 18% mai puțin comparativ cu rezultatele obținute cu IBC. Mai mult, utilizarea multiplă a celulelor fungice libere care nu cresc, a dus la o scădere notabilă a productivității lor.

CONCLUZII

Combinația potențialului biotehnologic promițător al R. oryzae celulele fungice cu caracteristici operaționale ridicate ale PVA-CG macroporos utilizate ca purtător de imobilizare au dus la crearea unui IBC nou. Un astfel de IBC asigură o productivitate ridicată a LA și este capabil să sintetizeze L (+) - LA de puritate optică ridicată și cu concentrație finală ridicată. În plus, funcționarea pe termen lung a IBC dezvoltat a fost implementată, atunci când diferite surse limitative de carbon au fost consumate de către imobilizați R. oryzae miceliu, Astfel s-a demonstrat potențialul acestui sistem pentru producția de LA.

Mulțumiri

Autorii sunt recunoscători prof. SP Sineoky (Colecția Națională Rusă de Microorganisme Industriale) pentru cultura fungică utilizată în aceste investigații. Agenția Federală pentru Știință și Inovații a Federației Ruse a sprijinit financiar această lucrare (contractul de stat nr. 02.434.11.3005).