Abstract

fundal

Candida vaginită este un risc global pentru sănătate care crește morbiditatea în rândul femeilor aflate la vârsta fertilă. Studii recente au relevat o incidență ridicată a rezistenței la medicamente Candida tulpini. În plus, tratarea candidei vulvovaginitei în timpul sarcinii este dificilă, deoarece terapia antifungică este asociată cu anomalii fetale. Prin urmare, este important să se dezvolte noi strategii terapeutice pentru tratarea candidozei vulvovaginale.

Metode

În acest studiu, am folosit metoda de difuzie a discului pentru a evalua activitatea anticandidă a diferitelor Syzygium aromaticum extracte (metanol, acetat de etil, n-hexan și dietil eter) împotriva C. albicans, C. glabrata, și C. tropicalis. Mai mult decât atât, analiza cromatografiei cu spectrometrie de masă (GC-MS) a diferitelor S. aromaticum extractele au fost efectuate pentru a determina componentele active care prezintă activitate anticandidă. A fost evaluată citotoxicitatea diferitelor extracte de cuișoare împotriva liniei celulare HUH7.

Rezultate

Extractul de acetat de etil a prezentat cea mai mare activitate antifungică împotriva C. albicans, C. glabrata, și C. tropicalis cu diametre ale zonei de inhibiție de 20,9, 14,9 și respectiv 30,7 mm. Concentrația minimă inhibitoare a S. aromaticum extractul de acetat de etil a fost de 250 μg/disc împotriva C. tropicalis, și 500 μg/disc împotriva C. albicans și C. glabrata, în timp ce concentrația fungicidă minimă a fost de 0,5 mg/disc împotriva C. tropicalis și 1 mg/disc împotriva C. albicans și C. glabrata. Analiza GC-MS a extractului de acetat de etil a relevat principalul compus bioactiv ca eugenol (58,88%), urmat de acetat de eugenil (23,86%), trans-cariofilenă (14,44%) și α-humulenă (1,88%). Testul de citotoxicitate a indicat faptul că extractul de dietil eter a demonstrat cel mai mic efect toxicologic împotriva liniei celulare HUH7, cu un IC50 relativ de 62,43 μg/ml; extractul metanolic a demonstrat o toxicitate mai mare (IC50, 24,17 μg/ml).

Concluzie

Dupa cum S. aromaticum extractul prezintă activitate antifungică ridicată la concentrații scăzute, poate fi o sursă potențială de medicamente antifungice naturale.

fundal

Metode

Pregătirea extractelor de plante

Procedura de extracție a fost efectuată utilizând diferiți solvenți organici (metanol, acetat de etil, dietil eter și n-hexan), demonstrând polarități diferite pentru a permite extragerea tuturor compușilor bioactivi hidrofili și lipofili. Mugurii florali ai S. aromaticum au fost obținute de pe o piață locală din Riyadh, Arabia Saudită. Am identificat materialul vegetal, iar identificarea a fost confirmată de ierbarul saudit, Departamentul de Botanică, Colegiul de Științe, Universitatea King Saud. Materialul vegetal a fost depus la ierbar cu un număr de voucher (KSU-14682). Mugurii de cuișoare au fost dezinfectați utilizând soluție de hipoclorit de sodiu 0,5% (NaOCl), spălați de trei ori succesiv folosind apă distilată sterilă și lăsați să se usuce. Materialul vegetal uscat a fost pulverizat omogen folosind un mortar mecanic. Proba sub formă de pulbere (15 g) a fost adăugată la 200 ml de diferiți solvenți organici și incubată pe un agitator magnetic timp de 48 de ore. Apoi, amestecul a fost centrifugat la 9000 rpm timp de 10 min pentru a îndepărta reziduurile. Supernatantul a fost filtrat folosind o hârtie de filtru Whatman pentru a obține un filtrat clar. Filtratul a fost concentrat utilizând un evaporator rotativ și depozitat la 4 ° C până la utilizare. Randamentul extractului a fost calculat folosind următoarea formulă:

unde R este greutatea reziduului extractului vegetal; S este greutatea probei de plante brute.

Candida izolează

Trei Candida specii, C. albicans, C. tropicalis, și C. glabrata au fost obținute de la spitalul King Khalid, Riyadh, Arabia Saudită. Inoculul proaspăt a fost preparat prin subcultivarea fiecăruia Candida specii pe mediu Agar dextroză Sabouraud (SDA) la 35 ° C timp de 48 de ore.

Pregătirea inoculului candidal

Slanturile SDA au fost preparate și inoculate cu diferite Candida specii. Ciuperca a fost recoltată folosind 5 ml soluție salină sterilă. Absorbanța suspensiei fungice a fost măsurată la 560 nm folosind un spectrofotometru și numărul de celule a fost ajustat pentru a obține un număr de celule viabil de 10 7 CFU/mL pentru fiecare Candida specii.

Bioanaliză anticandidă

Determinarea concentrației inhibitoare minime (MIC)

CMI a fost definit ca fiind cea mai mică concentrație de extract de plante care prezintă activitate antifungică. MIC a fost evaluat numai pentru extractul de acetat de etil al S. aromaticum ca cel mai eficient extract de cuișoare. Mediul SDA (15 ml) a fost turnat într-o cutie Petri sterilă ca strat bazal, urmat de adăugarea de 10 ml mediu însămânțat (așa cum s-a descris mai sus) și lăsat să se solidifice. Discuri de hârtie de filtru sterile (diametru 8 mm) încărcate cu concentrații diferite de S. aromaticum extract de acetat de etil (0,125, 0,25, 0,50, 1,0, 2,0 și 4,0 mg/disc) au fost plasate peste mediul însămânțat. Plăcile au fost incubate la 5 ° C pentru a permite difuzia extractului. Plăcile au fost apoi incubate la 35 ° C timp de 48 de ore și diametrul zonei de inhibare a fost măsurat folosind un etrier Vernier. Cea mai mică concentrație care a prezentat activitate antifungică împotriva Candida specia a fost înregistrată ca MIC.

Determinarea concentrației minime de fungicide

Concentrația fungicidă minimă (MFC) a fost definită ca cea mai mică concentrație a extractului de cuișoare care prezintă activitate fungicidă. Striații obținute din zona zonei de inhibare a MIC și două concentrații de succes au fost cultivate pe plăci SDA proaspăt preparate. Plăcile au fost incubate la 35 ° C timp de 48 de ore și cea mai mică concentrație care nu a prezentat nicio creștere fungică a fost înregistrată ca MFC.

Analiza cromatografiei în fază gazoasă-spectrometrie de masă (GC-MS) a S. aromaticum extrase

Analiza fitochimică a S. aromaticum extractele au fost efectuate de GC-MS pentru detectarea compușilor activi care prezintă activitate antifungică. Analiza GC-MS a fost efectuată utilizând GC-MS Thermo Trace GC Ultra/TSQ Quantum GC. Analiza fitochimică a fost efectuată folosind o coloană capilară TR5-MS, (30 m × 0,25 mm; grosimea filmului de 0,25 μm). Cuptorul a fost programat la o rată de rată de 6 ° C/min pentru a crește temperatura de la 40 la 200 ° C. Condițiile de funcționare au fost următoarele: heliu ca gaz purtător cu un debit de 1 mL/min, temperatura injectorului și a detectorului au fost de 250 ° C, raportul de împărțire a fost 1:50. Condițiile pentru spectrometria de masă au fost următoarele: intervalul de masă de la m/z, 40-400 amu; potențial de ionizare 70 eV; energie multiplicatoare electronică 2000 V. Constituenții chimici ai extractelor de muguri de cuișoare au fost identificați prin compararea rezultatelor analizei GC-MS cu datele referitoare la timpul de reținere și la masa spectrală din baza de date NIST.

Test de citotoxicitate

analize statistice

Susceptibilitatea Candida la diferite extracte de cuișoare a fost analizat cu GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, SUA) utilizând analiza unidirecțională a varianței și testul lui Tukey. Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard pentru triplice. Datele au fost considerate semnificative statistic atunci când P-valoarea a fost mai mică de 0,05.

Rezultate

Se extrage randamentul

Cel mai inalt S. aromaticum randamentul extractului (6,09%) a fost obținut folosind dietil eter, urmat de metanol (4,67%), n-hexan (3,02%) și acetat de etil (2,57%).

Activitatea anticandidă

MIC și MFC din S. aromaticum extract de acetat de etil

MIC din S. aromaticum extract de acetat de etil împotriva C. tropicalis a fost 0,25 mg/disc, cu un diametru al zonei de inhibiție de 8,4 mm. MIC împotriva C. albicans și C. glabrata a fost de 0,5 mg/disc, cu diametre ale zonei de inhibare de 8,83 și respectiv 8,07 mm (Tabelul 2). MIC din S. aromaticum extract de acetat de etil împotriva C. tropicalis a fost mai mică decât aceea împotriva ambelor C. albicans și C. glabrata. Prin urmare, C. tropicalis cel mai sensibil la acest extract de cuișoare (Fig. 1). MFC al S. aromaticum extrage împotriva C. tropicalis a fost de 0,5 mg/disc, deoarece nu a crescut Candida a fost observată la această concentrație. În mod similar, nu C. albicans și C. glabrata creșterea a fost observată la 1 mg/disc.

vitro

Concentrația minimă inhibitoare de S. aromaticum extract de acetat de etil împotriva Candida specii

Cromatografia gazoasă-analiza spectrometriei de masă (GC-MS) a S. aromaticum extrase

Analiza GC-MS a S. aromaticum extractul de acetat de etil a arătat că eugenolul (58,88%) a fost componenta activă cea mai abundentă, urmat de acetat de eugenil (23,86%), trans-cariofilena (14,44%), α-humulena (1,88%), oxid de cariofilină (0,74%) și longipinocarvonă (0,19%) (Tabelul 3 și Fig. 2). Mai mult, principala componentă bioactivă a extractului de dietil eter a fost eugenolul (66,48%), urmat de acetat de eugenil (31,73%), trans-cariofilenă (1,63%), oxid de cariofilenă (0,31%) și α-humulenă (0,21%) (Tabelul 4 și Fig. 3). În schimb, noii constituenți fitochimici detectați în S. aromaticum extractul metanolic a inclus cetone de mosc (2,78%), α-cubebenă (0,79%), chavicol (0,78%), β-cadinenă (0,59%) și α-farnesenă (0,37%). Au fost depistați și alți constituenți precum eugenol (55,58%), acetat de eugenil (19,83%), trans-cariofilenă (15,71%), α-humulenă (2,46%) și oxid de cariofilen (1,10%) (Tabelul 5 și Fig. 4 ). În mod similar, eugenolul (61,37%) a fost cea mai abundentă componentă bioactivă din extractul de n-hexan (Tabelul 6 și Fig. 5).

Cromatograma de S. aromaticum extract de acetat de etil

Cromatograma de S. aromaticum extract de dietil eter

Cromatograma de S. aromaticum extract metanolic

Cromatograma de S. aromaticum extract de n-hexan

Test de citotoxicitate

Extractul cu cui de dietil eter a demonstrat cel mai mic efect toxic împotriva liniei celulare HUH7, cu un IC50 relativ de 62,43 μg/ml, în timp ce o toxicitate mai mare a fost detectată cu extractul metanolic, cu un IC50 de 24,17 μg/ml. Mai mult, extractele de n-hexan și acetat de etil de cuișoare au prezentat toxicitate moderată împotriva celulelor HUH7 cu valori relative ale IC50 de 42,19 și respectiv 33,68 (Fig. 6).

IC50 din diferite extracte de cuișoare împotriva liniei celulare HUH7

Discuţie

Concluzie

Syzygium aromaticum extractele au prezentat o eficiență foarte antifungică împotriva celor mai frecvente și predominante tulpini care cauzează vaginită candidală. Acetatul de etil a fost cel mai eficient solvent organic în procesul de extracție, producând un randament ridicat de constituenți activi din cuișoare. Mai mult, rezultatele au demonstrat o potență ridicată a extractului de cuișoare în comparație cu terbinafină (martor). Prin urmare, ar putea fi utilizat ca agenți antifungici naturali, siguri și eficienți. Mai mult, ar putea fi prescris ca înlocuitor al mai multor agenți chimioterapeutici utilizați în terapia cu vaginită candidală pentru uz extern, eliminând efectele secundare extinse asociate cu acești agenți chimici, în special la femeile gravide.

Disponibilitatea datelor și a materialelor

Seturile de date utilizate și/sau analizate în timpul studiului actual sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.