• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: gabibov @ mx.ibch.rusidney.altman @ yale.edu

Contribuit de Sidney Altman, 7 ianuarie 2017 (trimis spre revizuire la 15 septembrie 2016; revizuit de Robert S. Phillips și Israel Silman)

microfluidice

Figurile articolelor și SI

Cifre

Schema principală a tehnicii MDE - FACS. Compartimentarea unei biblioteci de specii cu mașini specifice de generare a fluorescenței în MDE utilizând emulsificarea în cipuri microfluidice a permis testarea cu o singură celulă a unei funcții vizate. Doar fenotipurile specifice (indicate de steaua galbenă) se potrivesc și activează mașinile în picături, ducând astfel la producerea de substanțe fluorescente. Deoarece volumul picăturilor a fost uniform, concentrații și condiții similare au dus la o distribuție îngustă a fluorescenței care a corespuns aceleiași activități. Semnalul fluorescent a fost înregistrat de un sortator de celule convențional care a separat variantele care au activat mașinile (activatori) de cele care nu au (gunoi). Speciile neculturabile au fost analizate prin secvențierea directă a MDE. Dacă activatorii selectați ar putea fi cultivați in vitro, aceștia au fost regenerați din picături, crescuți și analizați printr-o combinație de metode clasice (cinetică, LC-MS, secvențierea și altele). W/O/W, emulsie dublă apă-în-ulei-în-apă.

Screeningul biocatalizatorilor ancorati pe suprafata drojdiei folosind MDE - FACS. (A) Compartimentarea celulelor de drojdie active (RFP-pozitive) și inactive (non-fluorescente) cu substrat fluorogen. După ce amestecul de celule active și inactive a fost încapsulat, produsul fluorescent s-a acumulat numai în interiorul picăturilor cu celule active, care au fost selectate folosind FACS. (B) Vizualizarea reacției biochimice prin fuzionarea semnalelor de fluorescență verde (produs de reacție), fluorescență roșie (proteină reporter) și a imaginii luminii vizibile. (Bară de scală, 100 μm.) (C) Graficul reprezintă eficiența îmbogățirii în funcție de diluarea celulelor active cu celule inactive după o rundă de MDE - FACS. (D) Eficiența îmbogățirii MDE - FACS pentru celulele active care prezintă diferiți biocatalizatori (DNază I, EK și BChE) și celule inactive (Fab) amestecate într-un raport 1: 1: 1: 100. (E) Selectarea mutanților BChE cu diferite niveluri de activitate din biblioteca BChE înainte de selecție (Lib) și după selecție folosind porțile G1 - G3. (Inserare) Suprapunerea spectrelor de picături MDE - FACS cu Fab, biblioteca BChE și WT BChE. Sunt indicate porțile utilizate pentru sortare. Mediile ± intervalele intercuartile sunt prezentate pentru fiecare grup. P

Incapsularea celulelor microfluidice în picături MDE. (A) Emulsificare secvențială în așchii cu o singură emulsie. (B și C) Geometriile canalelor de cipuri microfluidice utilizate pentru a produce MDE. (B) Cipul de 20 μm utilizat pentru încapsularea drojdiei. (C) Cipul de 60 μm utilizat pentru încapsularea bacteriilor și drojdiei. W/O, emulsie unică apă-în-ulei; W/O/W, emulsie dublă apă-în-ulei-în-apă.

Compartimentarea cu o singură celulă în picături a urmat statisticile Poisson. (A) Probabilitatea (P) de a găsi x celule în volumul fiecărei picături individuale a fost strict definită de parametrul λ, care este numărul mediu de celule din picături. (B) Vizualizarea schematică a ocupării picăturilor la λ = 0,5 (cea mai frecvent utilizată valoare în ecranele noastre). (C) Relațiile dintre puritatea teoretică maximă de sortare (puritate) și λ și procentul de picături cu celule unice (celulă unică) și λ.

Biblioteca mutanților BChE umani. (A) Mutanții BChE umani au substituții multiple de aminoacizi în bucla de legare a acilului 284 - TPLSV - 288 (galben) aproape de situsul activ. Triada catalitică este prezentată în gri. (B) Secvențe ale mutanților BChE selectați cu substituții în pozițiile 284 - TPLSV - 288 ale BChE umane WT.

Platforma MDE - FACS a permis selectarea enzimelor cu niveluri diferite ale aceleiași activități. (A și B) Porțiunea de mutanți BChE cu activitate ridicată (cl.3), medie (cl.8) și scăzută (cl.13) au fost selectate folosind G1 - G3 și controlează drojdiile după selecție folosind un nivel ridicat, mediu, și porțile joase (Fig. 2F) au fost determinate folosind PCR în timp real pentru amestecuri 1: 1: 1: 1 (A) și 1: 1: 1: 1.000 (B). (C și D) Îmbogățirea respectivă a pliurilor a fost calculată utilizând rapoartele inițiale 1: 1: 1: 1 (C) și 1: 1: 1: 1.000 (D). Asteriscurile indică faptul că nivelul cl.3 a fost prea scăzut pentru a fi determinat. Barele sunt colorate așa cum se arată în A. Datele reprezintă media ± SD (n = 3 replici tehnice).

Screeningul bibliotecii BChE utilizând MDE - FACS a permis selectarea mutanților rezistenți la inhibarea OP prin reactivitate de auto-reactivare sau afinitate scăzută la OP. (A) Schema de reacție care ilustrează formarea unui complex reversibil BChE - OP, formarea ireversibilă a aductului BChE - OP și auto-reactivarea BChE. Ki, constantă de inhibiție; k1, constanta vitezei de fosfilare; k2, constanta vitezei de auto-reactivare. Structuri ale OP utilizate pentru selecția mutanților rezistenți la OP (GDC, analiza cumarinei soman; POX, paraoxon; POX-R, analogul resorufinei POX). (B) Diagramele de inhibiție pseudo-primă care arată activitatea reziduală în funcție de timp după incubarea a 2 nM BChE cu 100 nM POX pentru cl.14 și cl.15 mutanți selectați pentru rezistență împotriva inhibării POX, control WT BChE și cl .19 selectat pentru rezistență împotriva inhibiției GDC. Toate punctele de date reprezentate sunt derivate din trei măsurători independente. (C) Constantele cinetice (valori medii ± SD, n = 3 replici tehnice) din schema de reacție în A estimată pentru WT BChE și mutanți. Celulele care indică constante care au fost modificate în mutanți selectați în raport cu WT BChE sunt evidențiate cu portocaliu pentru POX și albastru pentru GDC. ND, nicio activitate detectabilă, adică un nivel de activitate -6/s.

Eficiența îmbogățirii a fost limitată și a depins în mod dramatic de diluarea criminalului S. venezuelae în timpul selecției negative folosind un singur reporter GFP. (A) Picăturile cu cea mai mică fluorescență verde ar putea avea fluorescență verde scăzută datorită coincapsulării cu S. venezuelae sau absenței S. aureus (picături goale) care se împarte rapid. Porțiunea de picături goale a fost predeterminată de parametrul λ al încapsulării stochastice S. aureus; porțiunea de picături S. venezuelae pozitive a scăzut odată cu creșterea diluției S. venezuelae. (B) Selecția negativă a picăturilor (Fig. 3 C și D) a dus la îmbogățirea S. venezuelae ucigașă mai degrabă decât la celulele E. coli mate. Valorile teoretice au fost calculate din statisticile Poisson (Fig. S2) la λ = 1. Punctele de date experimentale reprezentate sunt derivate din trei măsurători; bare de eroare denotă SD (n = 3 replici tehnice).