Omogenizările pot fi produse prin stoarcerea și frecarea țesutului într-o pungă de plastic sau prin utilizarea unui blender peristaltic.

Termeni asociați:

  • Anticorpi
  • Enzimă
  • Proteină
  • ADN
  • LD50
  • Supernatant
  • Ion calciu

Descărcați în format PDF

Despre această pagină

Sisteme de comportament hormonal non-mamifer

Gregory F. Ball, Jacques Balthazart, în Hormoni, creier și comportament (ediția a treia), 2017

2.11.6.4.1 Studii in vitro

Activitatea aromatazică în omogenatele preoptice de prepeliță s-a dovedit a fi rapid inhibată de condițiile de fosforilare (creșteri în intervalul fiziologic al concentrațiilor de ATP, Mg 2+ și Ca 2+) și acest proces a fost blocat în prezența diferiților inhibitori ai protein kinazei. Această inhibiție a fost abolită în prezența 1 mM EGTA, care chelează Ca 2+ liber prezent în omogenate (Balthazart și colab., 2001a, 2003).

Analizele genei aromatazei într-o varietate de specii de mamifere și aviare, inclusiv prepelița, au demonstrat că mai multe situri consensuale de fosforilare (tirozină și serină/treonină reziduuri) sunt prezente în aceste secvențe de aromatază (a se vedea detaliile în Balthazart și colab., 2003; Charlier și colab. ., 2011a). Studii suplimentare au demonstrat că aceste procese de fosforilare reglează, de asemenea, activitatea enzimatică a aromatazei în ovarul prepelițelor și a aromatazei umane transfectate în diferite linii celulare și că activitatea scăzută a fost asociată cu o fosforilare crescută a proteinei aromatazei. Încercările de a identifica prin mutageneză direcționată către situs reziduurile specifice de aminoacizi a căror fosforilare mediază modificări ale activității enzimatice nu au avut totuși succes (Charlier și colab., 2011a).

Studiile cu explante in vitro ale hipotalamusului POA au demonstrat în continuare că inhibițiile rapide (în decurs de 5 minute) ale aromatazei probabil (deși nu sunt demonstrate formal) mediate de fosforilările dependente de Ca 2+ au loc și în neuronii intacti. Aceste inhibiții pot fi declanșate de depolarizări induse de K +, expunerea la thapsigargin, o lactonă cunoscută pentru capacitatea sa de a mobiliza bazine intracelulare de Ca 2+ sau expunerea la agoniști ai receptorilor glutamat (AMPA (acid amino-metil-4-isoxazol propionic) ), kainat și într-o măsură mai mică NMDA (acid N-metil-d-aspartic)) și sunt complet reversibile (Balthazart și colab., 2001a, 2006). Activitatea aromatazei umane transfectate în linii celulare inițial negative a fost în mod similar scăzută printr-o depolarizare indusă de K + și complet restabilită în timpul perioadei de spălare. În mod interesant, studiile Western blot au demonstrat că activitatea enzimatică scăzută în condiții de depolarizare nu corespunde cu o scădere a concentrației proteinei enzimatice indusă de exemplu de degradare (Charlier și colab., 2011a).

CONSERVATOARE Analiză

Alți conservanți

Bifenil

Distilarea cu abur a omogenatului de coajă de citrice și extracția distilatului cu heptan oferă o probă care poate fi analizată pentru bifenil prin TLC pe silicagel cu heptan ca solvent în curs de dezvoltare. Analiza cantitativă se realizează prin extragerea bifenilului din mediul TLC cu etanol și măsurarea absorbanței soluțiilor rezultate la 248 și 300 nm. Absorbanta la 300 nm este folosita pentru corectarea absorbantei de fond. Sunt disponibile și metode de analiză GLC.

Tiabendazol

Tiabendazolul poate fi extras din alimente cu acid (HCI), în care este redus ulterior cu zinc în glicerol 30% + fenilendiamină. Oxidarea ulterioară cu ioni ferici dă naștere unui complex albastru, care este extras în butanol pentru măsurarea spectrofotometrică.

Acid lactic

Metodele standard pentru determinarea acidului lactic implică conversia acestuia în complexul Fe (III) pentru măsurarea spectrofotometrică sau prin GLC după metilare completă. Într-o procedură enzimatică, acidul lactic este transformat în piruvat de NAD + (lactat dehidrogenază); produsul este prins prin reacția cu glutamat (glutamat - piruvat transaminază) pentru a deplasa echilibrul acid lactic - piruvat spre dreapta. Rata de utilizare a NAD + este utilizată pentru a măsura concentrația de acid lactic. Pregătirea probei este în general așa cum este descris pentru acizii carboxilici de mai sus.

Apă oxigenată

Testele la fața locului pentru prezența peroxidului de hidrogen în lapte utilizează fie o soluție de pentoxid de vanadiu în H2SO4 (culoare roz sau roșu), fie KI/amidon (culoare albastră).

Analiza cantitativă se face cu peroxidază și un substrat adecvat. O-dianisidina frecvent recomandată este cancerigenă și sunt preferate substraturi precum guaiacol sau 2,2'-azinobis (acid 3-etilbenztiazolidină-6-sulfonic). Testele pe probe de lapte se efectuează după precipitarea proteinei prin ajustarea la pH 4,5 cu HCI.

Nisin

Complexitatea procedurilor pentru izolarea și cuantificarea chimică a nisinei a condus la dezvoltarea testelor microbiologice ca proceduri normale de analiză. O unitate internațională de activitate a nisinei este gradul de inhibare a unui microorganism testat cauzat de aproximativ 25 ng de nisină pură. Un microorganism de testare adecvat este Streptococcus agalactiae. O procedură specială de testare este o adaptare a testului de reducere a albastrului de metilen; întârzierea decolorării colorantului este proporțională cu concentrația de nisină într-un interval de concentrație de 10 ori. O nouă metodă de analiză implică testul imunosorbent legat de enzime, care este mult mai simplu decât testul microbiologic și ar trebui să devină popular.

Toxicologie renală

KG. Dickman, A.P. Grollman, în Comprehensive Toxicology, 2010

7.18.4.2.4 Toxicocinetica

Spre deosebire de prezența sa variabilă în urină și sânge, orellanina este detectată frecvent în probele de biopsie renală, unde toxina poate fi reținută într-o formă solubilă timp de 6 luni post-digestie (Andary și colab. 1989; Franz și colab. 1996; Holzl și colab. 1997; Rohrmoser și colab. 1997). Orellina, metabolitul di-reducere, a fost de asemenea găsit în biopsiile renale în cazurile de otrăvire cu orellanină și probabil că provine fie din ciuperca însăși, fie din metabolismul extra- sau intrarenal al orellaninei. Prezența continuă a orellaninei în cortexul renal după hemodializă și prezența sa persistentă în acest țesut timp de câteva luni, în absența orellaninei detectabile în urină sau sânge, sugerează că toxina este sechestrată în rinichi într-o formă slab schimbabilă. Au fost făcute observații similare in vitro în care doar 25% din orellanină adăugată la omogenizarea rinichilor ar putea fi recuperată, comparativ cu recuperarea completă atunci când a fost adăugată la ser (Holmdahl și colab. 1987).

Încercările de creștere a clearance-ului orellaninei prin utilizarea hemodializei, hemoperfuziei sau plasmaforezei, utilizate singure sau în combinație, au fost ineficiente în prevenirea progresiei către insuficiență renală cronică (Busnach și colab. 1983; Holmdahl și Blohme 1995; Holmdahl și colab. 1984; Montoli și colab. 1999). Având în vedere apariția întârziată a simptomelor asociate cu otrăvirea cu orellanină, această lipsă de eficacitate este în general atribuită utilizării acestor tratamente târziu în cursul bolii, în mod obișnuit câteva zile după punerea în discuție și într-un moment în care insuficiența renală acută este deja evidentă. Cu toate acestea, această noțiune este contestată de constatările lui Montoli și colab. (1999), care au raportat că schimbul de plasmă a început încă de la 44 ore post-digestie nu a reușit să prevină dezvoltarea insuficienței renale acute 8 zile mai târziu. Acest lucru sugerează că orellanina se acumulează rapid în rinichi și că evenimentele celulare critice care duc la insuficiență renală acută câteva zile mai târziu sunt inițiate la scurt timp după expunere.

Majoritatea informațiilor actuale referitoare la nefrotoxicitatea orellaninei provin din rapoarte de cazuri de otrăviri umane și din experimente pe animale. Datorită naturii acestor studii, nu se știe dacă nefrotoxina finală este însăși orellanina sau un metabolit. S-a raportat că pretratarea cu fenobarbital crește leziunile unui model de toxicitate la rozătoare, sugerând posibila implicare a bioactivării (Nieminen 1976). În mod similar, bioactivarea prealabilă a orellaninei de către microsomi hepatici a fost absolut necesară pentru efectul său inhibitor asupra sintezei proteinelor într-un test de traducere in vitro (Richard și colab. 1991). Natura metabolitului (metabolitilor) este necunoscută. În cazurile de otrăvire umană, nici fenotipurile de acetilare, nici hidroxilarea nu sunt corelate cu incidența insuficienței renale (Bouget și colab. 1990).

Rabia

Vaccinuri pentru țesuturi nervoase (NTV).

Deși sunt eliminate treptat, aceste omogenizate ale creierului animal infectat sunt încă utilizate în unele țări din Asia, Africa și America de Sud. Vaccinul Semple pentru creierul de oaie, produs pentru prima dată în 1911, este utilizat în Pakistan. Șapte până la 14 injecții zilnice sunt administrate subcutanat (SC) peste peretele abdominal anterior; o suprafață mare capabilă să găzduiască dozele de 2-5 ml de vaccin. Vaccinul pentru creierul șoarecelui Fuenzalida este utilizat în părți din America de Sud și Africa. Potența NTV-urilor este variabilă și apar eșecurile tratamentului. Acestea nu trebuie utilizate pentru profilaxia pre-expunere. Deși encefalita post-vaccinală este o complicație gravă, tratamentul post-expunere este urgent, deci dacă este singurul vaccin disponibil, tratamentul poate fi început și schimbat în vaccin cu cultură tisulară în orice moment.

Perturbarea neuroendocrină

9.5.2 Proceduri

Într-o microplacă pentru fluorescență, amestecați 40 µL de omogenizat, fracțiune de mitocondrie (mai bună) sau tampon de omogenizare (gol), 10 µL de tiramină, 20 µL de diclorofluoresceină diacetat/soluție de peroxidază, 10 µL de aminotriazol și 20 µL de tampon de analiză. Aminotriazolul previne hidroliza H2O2 de către catalaze. Se incubează între 30 și 60 de minute la 30 ° C și se iau citiri de fluorescenă la excitație de 485 nm și emisie de 525 nm la fiecare interval de 10 minute. În godeuri separate, se prepară un semifabricat doar cu supernatantul, care ar putea conține urme de peroxidază endogenă și H2O2 fără adăugarea de tiramină (înlocuită cu tamponul de testare). Pentru calibrare, un tampon tampon și fluoresceina standard 0,1 uM sunt preparate în tamponul de testare.

Serotonina

Julie G. Hensler, Julie G. Hensler, în Neurochimie de bază (ediția a opta), 2012

Receptorul 5-ht1E

Receptorul 5-ht1E a fost identificat inițial în omogenatele cortexului frontal uman prin studii de legare a radioligandului folosind [3 H] -5-HT în prezența 5-CT pentru a bloca siturile receptorilor 5-HT1A și 5-HT1D. Din cauza lipsei de radioliganzi specifici pentru receptorul 5-ht1E, distribuția generală a acestui receptor în creier este necunoscută. ARNm al receptorului 5-ht1E a fost găsit în cortex (în special cortex entorinal) și putamen caudat. Funcția receptorului 5-ht1E în țesutul intact nu este cunoscută din cauza lipsei de agoniști sau antagoniști selectivi. În celulele transfectate, receptorul 5-ht1E este cuplat la inhibarea activității adenilil ciclazei (Zgombick și colab., 1992). Receptorul 5-ht1E prezintă un grad mai mare de omologie cu receptorul 5-HT1D (64%) decât orice alt receptor 5-HT1. Deși mARN-ul receptorului 5-ht1E și siturile de legare au fost cartografiate în rozătoare și creierul uman, confirmarea unui rol fiziologic adevărat pentru receptorii 5-ht1E este încă lipsită; prin urmare, își păstrează apelul cu litere mici (Hannon & Hoyer, 2008).

Autoreglarea creșterii și funcției tiroidiene de către iod

Iodolipide tiroidiene

Alți iodocompuși decât hormonii tiroidieni au fost detectați în omogenizații tiroidieni, iar iodolipidele au fost cunoscute din studiile de încorporare a iodului radioactiv de la începutul anilor 1950 (Taurog și colab., 1957). Rolul lor fiziologic era necunoscut, dar sa sugerat că este implicat în autoreglarea tiroidei.

Compușii specifici au fost identificați atunci când au fost utilizate metode noi foarte sensibile, cum ar fi cromatografia gazoasă-spectrometria de masă (GC-MS) și rezonanța magnetică nucleară. Când un acid gras exogen, cum ar fi acidul arahidonic sau acidul docosahexanoic, a fost suplimentat, formarea derivaților iodati a putut fi demonstrată în feliile de tiroidă de șobolan (Boeynaems și Hubbard, 1980). Principalul produs al conversiei din acid arahidonic a fost identificat ca acid 6-iodo-5-hidroxi-8,11,14-eicosatrienoic δ-lactonă (δ-iodolactonă, pentru formula vezi Figura 25.2) in vitro în foliculii tiroidieni porcini, precum și in vivo în țesutul tiroidian uman derivat de la pacienții tratați cu doze mari de iod înainte de operație (Dugrillon și colab., 1994).

omogenizare

Figura 25.2. Formule de iodolactone, derivate din acid arahidonic, acid docosahexaenoic și acid eicosapentaenoic. Adaptat din Gärtner și colab., (1996).

Potrivit lui Pereira și colab. (1990) 2-iodohexadecanal (2-IHDA) ar putea fi identificat ca fiind iodolipidul major în glanda tiroidă a calului. Acest compus major a fost probabil văzut mai devreme ca o lipidă polifosfatidică de către investigatori care utilizează cromatografie în strat subțire (Taurog și colab., 1957). Acest compus este probabil format prin adăugarea de iod la grupul vinil eter al plasmalogenilor.

Tehnici de filtrare a membranei cu rețea hidrofobă

Asigurarea validității MPN

Anumite condiții privind distribuția microorganismelor în proba omogenizată și pe HGMF trebuie îndeplinite pentru ca determinarea MPN să fie aplicată cu încredere. În primul rând, microorganismele vizate pentru enumerare trebuie distribuite aleatoriu pe întreaga porțiune de eșantion care urmează să fie filtrată. În al doilea rând, fiecare microorganism individual din porțiunea de probă filtrată trebuie să aibă șanse egale de aterizare în oricare dintre pătratele rețelei individuale. În cele din urmă, fiecare pătrat trebuie să fie la fel de capabil să susțină creșterea microorganismelor țintă.

Prima și a doua condiție depind de pregătirea și amestecarea corectă a omogenizării probei, utilizarea echipamentului de filtrare și a tehnicilor de manipulare corecte, plasarea atentă a aparatului de filtrare pe balonul sau colectorul său și plasarea corectă a filtrului cu membrană pe filtrare ca în figurile 2 și 3. Dacă, de exemplu, unitatea de filtrare nu este poziționată vertical, suprafața pe care se sprijină HGMF va fi înclinată, rezultând volume inegale de filtrare a lichidului prin fiecare dintre pătratele individuale. Această situație invalidează condiția de probabilitate egală de distribuție a microorganismelor între toate pătratele rețelei. A treia condiție de validitate depinde de contactul complet între suprafața mediului de cultură și partea inferioară a HGMF și de capacitatea egală a tuturor pătratelor de rețea de a transfera substanțele nutritive prin acțiune capilară din mediul de cultură pe suprafața superioară a pătratului. De exemplu, o bulă de aer prinsă între suprafața agarului și partea inferioară a HGMF ar împiedica transferul nutrienților pe suprafața superioară a filtrului, inhibând astfel creșterea oricărui microorganism țintă care ar putea fi prezent în acele pătrate direct peste aer. balon.

Figura 2. Filtrul cu membrană a rețelei hidrofobe fiind poziționat pe baza unui aparat de filtrare.

Figura 3. După amplasarea HGMF, pâlnia de filtrare este rotită într-o poziție verticală și fixată utilizând o clemă de fixare din oțel inoxidabil. Prefiltrul din oțel inoxidabil (dimensiunea porilor de 5 μm) situat în partea inferioară a porțiunii cilindrice a pâlniei protejează particulele de alimente în timpul procesului de filtrare.