Alexandre V. Ivachtchenko, Yan A. Ivanenkov, Oleg D. Mitkin, Pavel M. Yamanushkin, Vadim V. Bichko, Natalia A. Shevkun, Olga V. Mokrushina, Olga O. Nevolina, Ruben N. Karapetian, Irina A. Leneva, Irina T. Fedyakina, Mark S. Veselov, candidat la medicament anti-gripal oral AV5075S, Jurnalul de chimioterapie antimicrobiană, volumul 69, numărul 5, mai 2014, paginile 1311–1324, https://doi.org/10.1093/jac/ dkt507

noul

Abstract

Dezvoltarea unui medicament nou candidat cu activitate îmbunătățită împotriva virusului gripal neuraminidază (NA) în comparație cu terapiile disponibile în prezent.

Compușii sintetizați au fost evaluați in vitro și in vivo. Andocarea moleculară tridimensională a fost aplicată cu succes pentru a clasifica compușii din serie după potența inhibitoare. Stabilitatea a fost investigată pe probe de sânge și pe modele animale. Un studiu farmacocinetic a fost efectuat la câini și șobolani utilizând administrare orală și intravenoasă.

Un nou medicament puternic candidat [[3R, 4R, 5S) -4- (2,2-difluoroacetilamino) -5-amino-3- (1-etil-propoxi) -ciclohex-1-enecarboxilic; AV5027] și esterul său etilic promedical (AV5075S) au fost sintetizate și testate. AV5027 și AV5075S prezintă activitate picomolară împotriva virusului gripal NA. AV5075S a inhibat NA într-un model de pneumonie utilizând virusul A/Aichi/2/68 (H3N2) adaptat la șoarece semnificativ mai puternic decât fosfatul de oseltamivir. O cale metabolică generală a fost construită pentru compusul părinte pe baza rezultatelor experimentale și a analizelor teoretice.

AV5075S poate fi considerat în mod rezonabil ca un candidat nou pentru medicamente orale „următorul din clasă” pentru tratamentul gripei.

Introducere

Structurile oseltamivirului, analogilor săi, zanamivirului, laninamivirului și compușilor descriși în această lucrare (AV5027, AV5075, AV5095, AV5102 și AV5092).

Structurile oseltamivirului, analogilor săi, zanamivirului, laninamivirului și compușilor descriși în această lucrare (AV5027, AV5075, AV5095, AV5102 și AV5092).

Recent, am anunțat un nou compus [[3R, 4R, 5S) -4- (2,2-difluoroacetilamino) -5-amino-3- (1-etil-propoxi) -ciclohex-1-enecarboxilic; AV5027] cu activitate picomolară împotriva gripei NA. 6 În plus, a fost realizat un studiu detaliat structură cantitativă - relație de activitate (QSAR) utilizând andocare moleculară tridimensională și analiză de regresie clasică. Aici, descriem caracteristicile farmacocinetice cheie și activitățile in vitro și in vivo (modele animale) ale analogilor AV5027 (AV5075, AV5095, AV5102 și AV5092) (Figura 1), mesilați (AV5075S și AV5095S) și metaboliți. Am constatat că AV5095 s-a format într-o soluție neutră în plasma umană, câine și șobolan prin acilarea AV5075.

Materiale și metode

Viruși

A/California/7/2009 (H1N1) a fost obținut de la ATCC (Manassas, VA, SUA). A/Aichi/2/68 (H3N2) adaptat la șoarece a fost obținut de la Institutul de Virologie Ivanovsky (Moscova, Rusia). Cristalele N1 purificate din virusurile A/California/7/2009 (H1N1) au fost obținute de la ATCC.

Animale

Șoareci de sex feminin albi, fără patogeni specifici (12-14 g), au fost obținuți de la creșa „Andreevka” (regiunea Moscovei, Rusia). Șoarecii au fost în carantină timp de 24 de ore înainte de infecție. Șoarecii CD1 fără patogeni specifici (vârsta de 6 săptămâni) și șobolanii Sprague-Dawley (250-350 g) au fost obținuți de la filiala de creștere a animalelor de laborator a Institutului de chimie bioorganică, Academia Rusă de Științe (regiunea Moscovei, Rusia). Câinii beagle pubescenți de ambele sexe (10-12 kg) au fost obținuți de la Centrul de reproducere a animalelor, Centrul rus de cercetare a substanțelor active biologic (regiunea Moscovei, Rusia). Șobolanii Sprague-Dawley au fost în carantină timp de 10 zile înainte de studiul farmacocineticii. Animalele au fost ținute în încăperi separate cu un microclimat controlat (temperatura 18-26 ° C, umiditate relativă 30% ± 70%, 8-10 volume de aer din cameră pe oră și 12 ore ciclu zi/noapte). Întreținerea și îngrijirea au fost în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. 7

Analiza NA

Efectul compușilor asupra activității NA a fost măsurat utilizând protocolul OMS. 8 Sarea de sodiu a acidului 2- (4-metilumbeliferil) -α-d-N-acetilneuraminic (MUNANA; Sigma, nr. Cat. M8639), la o concentrație finală de 0,1 mM, a fost utilizată ca substrat fluorescent. Virusul alantoic diluat conținând 800–1200 unități de fluorescență a MUNANA a fost amestecat cu compusul testat (0,01-10 000 nM) în 33 mM acid 2- (N-morfolino) etansulfonic (pH = 6,5) conținând 4 mM CaCl2 și incubat timp de 30 de minute la 37 ° C. După adăugarea substratului și incubarea la 37 ° C timp de 1 oră, reacția a fost oprită prin adăugarea 0,14 M NaOH în 83% etanol. Fluorescența a fost măsurată la o lungime de undă de excitație de 360 ​​nm și o lungime de undă de emisie de 448 nm. Semifabricatele de substrat au fost scăzute din citirile probei. Valorile IC50 au fost apoi calculate prin reprezentarea grafică a procentului de inhibare a activității NA față de concentrația inhibitorului. Rezultatele au fost raportate ca media a trei experimente.

Andocare moleculară tridimensională

Andocarea moleculară a fost efectuată folosind software-ul ICM-Pro (site-ul oficial: www.molsoft.com) 9 și datele cristalografice pentru proteinele izolate din virusurile de tip gripal care erau disponibile în PDB (site-ul oficial: www.rcsb.org). 10 Pentru modelarea in silico, am utilizat datele cristalografice obținute pentru gripa H1N1 NA în complex cu carboxilat de oseltamivir (cod PDB: 3TI6). 11 Modul de legare pentru carboxilat de oseltamivir a fost comparat cu cel observat pentru laninamivir 12 și zanamivir. 11

Chimie

Chimia generală și analitică, precum și protocoalele sintetice, sunt prezentate în datele suplimentare (disponibile la JAC Online). Carboxilatul de oseltamivir și fosfatul de oseltamivir au fost preparați așa cum s-a descris anterior. 6 [(3R, 4R, 5S) -5-amino-4- (2,2-difluoroacetilamino) -3- (acid 1-etil-propoxi) -ciclohex-1-enecarboxilic] ester etilic (AV5075S) a fost sintetizat din acidul comercial (3R, 4R, 5S) -4-amino-5-butoxicarbonilaminoamino-3- (1-etil-propoxi) -ciclohex-1-enecarboxilic acid și esterul etilic corespunzător 13, 14 (vezi Schema S1, disponibil ca Date suplimentare la JAC Online). Acidul (3R, 4R, 5S) -4-amino-5- (2,2-difluoroacetamido) -3- (1-etilpropoxi) ciclohex-1-enecarboxilic (AV5102) și esterul său etilic (AV5095) au fost sintetizate din (3R, 4R, 5S) -etil-4-amino-5-azido-3- (1-etilpropoxi) ciclohex-1-enecarboxilat. 15 AV5095S și AV5102 au fost pregătite așa cum se arată în Schema S2 (disponibil ca date suplimentare la JAC Online).

Stabilitatea in vitro a AV5075S, AV5095S și AV5027 în tampoane și plasmă

Stabilitatea in vitro a AV5075S, AV5095S și AV5027 a fost evaluată așa cum s-a descris anterior. 16-18 compuși au fost incubați în tampoane universale (1 μM) la pH = 2, 4 sau 7,4 și în plasma umană, câine și șobolan în duplicat la 37 ° C cu agitare ușoară. Alicote (60 μL) au fost colectate la puncte de timp predeterminate (0, 1, 4 și 24 h), urmate de extracție cu acetonitril (180 μL) conținând 50 ng/ml de tolbutamidă standard internă. Probele au fost incubate la -20 ° C timp de 15 minute și apoi centrifugate la 2000 g timp de 10 min. Supernatantele au fost analizate prin LC-MS/MS. Acetonitrilul, DMSO, acidul formic și apa au fost de calitate HPLC (Panreac). Tolbutamida și verapamilul au fost obținute de la Sigma. Plasma umană colectată în citrat de sodiu plasma de șobolan Sprague-Dawley și plasma canină (rasă mixtă) în Na2 EDTA au fost obținute de la Innovative Research (Novi, MI, SUA). Tamponul universal a fost obținut de la pION-Inc. (SUA) și utilizat la pH-ul dorit.

Farmacocinetica AV5075S, AV5095S și AV5092

Analiza LC-MS/MS a probelor după studii de stabilitate și farmacocinetice

Un spectrometru de masă (QTRAP 5500; AB Sciex, SUA) cuplat cu un sistem UPLC (1290 Infinity; Agilent Technologies, Inc., SUA) a fost utilizat cu o coloană YMC-Triart C18 (1,9 μm/12 nm/50 × 2 mm) . Gradul de eluție a fost utilizat (debit: 0,4 ml/min) cu o fază mobilă de apă/acetonitril cu 0,1% acid formic. Compușii au fost ionizați în modul de ionizare electrospray pozitiv. Tranzițiile de masă au fost după cum urmează: pentru AV5075S și AV5095S, m/z 349,2 → 120,0; pentru AV5027, m/z 321,0 → 251,0; pentru AV5102, m/z 321,0 → 138,0; și pentru AV5092, m/z 243,2 → 138,0. S-au utilizat zone standardizate interne standard sub curbă (ASC) pentru a calcula medicamentul părinte rămas la fiecare punct de timp în studiile de stabilitate (relativ la t = 0 min în%). Concentrațiile au fost determinate din curbele de calibrare standard în intervalul 1-4000 ng/mL. Datele farmacocinetice au fost analizate utilizând software-ul WinNonlin (Phoenix Corp., SUA) cu modele necompartimentale. Parametrii calculați au inclus concentrația plasmatică maximă (Cmax) și timpul (Tmax), aria sub curba concentrației plasmatice de la primul până la ultimul punct de timp (AUC0 - t) și cu extrapolarea liniară la infinit (AUC0 - ∞), rata de eliminare constantă (kel), timpul de înjumătățire (t½), timpul mediu de ședere, clearance-ul (CL) și volumul de distribuție (V). Biodisponibilitatea orală a fost calculată pe baza ASC0 - t.

Evaluarea eficacității in vivo

Rezultate

Inhibiția NA in vitro

Pe baza probabilității ca compușii prezentați (AV5027, AV5102 și AV5092) să inhibe NA, dat fiind că compusul de plumb (oseltamivir) este un inhibitor de NA bine justificat, au fost testați utilizând testul NA descris mai sus. Valorile IC50 împotriva NA/A/California/7/2009 (H1N1) virale sunt prezentate în Tabelul 1 cu carboxilat de oseltamivir și zanamivir ca martori. Aceste rezultate indică în mod clar că toți compușii au inhibat NA de la acest virus. Cu toate acestea, valorile IC50 au acoperit o gamă relativ largă. AV5102 (IC50 = 16,49 ± 9,59 nM) și AV5092 (IC50 = 29,31 ± 8,3 nM) au fost semnificativ mai puțin activi decât carboxilatul de oseltamivir (IC50 = 2,14 ± 0,13 nM) și zanamivir (IC50 = 0,49 ± 0,11 nM), cu suprapunere semnificativă în SEM . Rețineți că AV5027 (IC50 = 0,18 ± 0,03 nM) a fost de ± 3 și de 12 ori mai puternic decât zanamivirul și respectiv carboxilatul de oseltamivir.

Potența de inhibare a compușilor testați împotriva A/California/7/2009 (H1N1) gripă NA