Klára Šíchová

1 Departamentul de Neurobiologie Experimentală, Institutul Național de Sănătate Mintală, Klecany, Republica Cehă

Nikola Pinterová

1 Departamentul de Neurobiologie Experimentală, Institutul Național de Sănătate Mintală, Klecany, Republica Cehă

2 Facultatea a III-a de Medicină, Universitatea Charles din Praga, Praga, Republica Cehă

Monika Židková

3 Institutul de Medicină Legală și Toxicologie, Prima Facultate de Medicină, Universitatea Charles din Praga, Praga, Republica Cehă

Rachel R. Horsley

1 Departamentul de Neurobiologie Experimentală, Institutul Național de Sănătate Mintală, Klecany, Republica Cehă

Eva Lhotková

1 Departamentul de Neurobiologie Experimentală, Institutul Național de Sănătate Mintală, Klecany, Republica Cehă

Kristýna Štefková

1 Departamentul de Neurobiologie Experimentală, Institutul Național de Sănătate Mintală, Klecany, Republica Cehă

Chestmir Weymol

1 Departamentul de Neurobiologie Experimentală, Institutul Național de Sănătate Mintală, Klecany, Republica Cehă

2 Facultatea a III-a de Medicină, Universitatea Charles din Praga, Praga, Republica Cehă

Libor Uttl

1 Departamentul de Neurobiologie Experimentală, Institutul Național de Sănătate Mintală, Klecany, Republica Cehă

4 Departamentul de Fiziologie, Facultatea de Științe, Universitatea Charles, Praga, Republica Cehă

Marie Balíková

3 Institutul de Medicină Legală și Toxicologie, Prima Facultate de Medicină, Universitatea Charles din Praga, Praga, Republica Cehă

Martin Kuchař

1 Departamentul de Neurobiologie Experimentală, Institutul Național de Sănătate Mintală, Klecany, Republica Cehă

5 Laborator criminalistic al compușilor activi biologic, Departamentul de chimie a compușilor naturali, Universitatea de chimie și tehnologie Praga, Praga, Republica Cehă

Tomáš Páleníček

1 Departamentul de Neurobiologie Experimentală, Institutul Național de Sănătate Mintală, Klecany, Republica Cehă

2 Facultatea a III-a de Medicină, Universitatea Charles din Praga, Praga, Republica Cehă

Abstract

Introducere

Mefedrona (4-metilmetacatinonă, 4-MMC; MEPH, în continuare), un derivat sintetic al catinonei a fost sintetizată pentru prima dată în 1929 cu scopul dezvoltării acestui compus în scopuri terapeutice (1). La începutul secolului al XXI-lea, MEPH a fost redescoperit de utilizatorii recreativi (ca așa-numită „nouă substanță psihoactivă”: NPS) și, datorită efectelor sale psihoactive, a devenit utilizat pe scară largă ca drog de petrecere cunoscut sub numele străzii „ miau miau ”(2, 3). Pe baza rapoartelor utilizatorilor, efectele MEPH sunt foarte asemănătoare cu amfetamina, cu 3,4-metilendioximetamfetamina (MDMA) și cu cocaina sau combinația lor (4-6). Efectele MEPH sunt rapide și de durată relativ scurtă, în funcție de calea de administrare (intranazal:

2–3 х) (7, 8), rezultând o tendință pentru utilizatorii recreativi de a re-doza, așa cum este cazul cocainei (9, 10). Utilizarea prelungită și/sau polidrog [inclusiv „trântirea” - injecția intravenoasă de MEPH combinată cu alte medicamente (11)] poate fi asociată cu efecte psihologice adverse (de exemplu, paranoia, depresia, atacurile de panică), cardiovasculare sau efecte renale (12, 13). Mai mult, au fost documentate cel puțin 90 de decese în cazul în care MEPH singur (sau combinația sa cu alți compuși psihoactivi) a fost implicat (14-17). În 2010, MEPH a fost clasificat ca substanță controlată în unele țări europene, iar 2 ani mai târziu în SUA (7). În ciuda interdicției sale, a rămas până astăzi un drog recreativ popular (18, 19).

Mefedrona acționează ca un inhibitor neselectiv al absorbției monoaminei și eliberează cu raportul de inhibare a transportorului de dopamină: transportul serotoninei (DAT: SERT) fiind de 1,4, ceea ce i-a determinat pe autori să eticheteze MEPH ca un compus mixt asemănător MDMA-cocaină (20, 21). Cu toate acestea, în timp ce absorbția de dopamină (DA) de către MEPH este aproximativ echivalentă cu cea a serotoninei (5-HT), este (cum ar fi MDMA sau catinonă) de câteva ori mai puternică la transportorul nor-epinefrină (NET), raportul NET: DAT fiind aproximativ 13 (20). MEPH este, de asemenea, activ pe transportorii veziculari de monoamină 2, unde activitatea sa este de aproximativ 10 ori mai puțin puternică decât MDMA (22). Contrastând parțial studiile de transport, conform studiilor de microdializă in vivo efectuate pe nucleus accumbens (NAcc), MEPH a avut un efect de două ori mai mare asupra 5-HT decât eliberarea DA (23, 24). Mai mult, MEPH are, de asemenea, o anumită activitate la serotonina 5-HT2A, noradrenalina α1,2 și receptorul asociat aminei (TAAR1). Afinitatea pentru DAT împreună cu permeabilitatea ridicată a barierei hematoencefalice (de două ori mai mare decât amfetamina și MDMA) (20) și efectele directe asupra DA în NAcc fac din MEPH un compus cu potențial de dependență ridicat, confirmat de utilizatori (10, 20, 25, 26) și prin studii pe animale (27-29). Afinitatea sa puternică pentru NET ar putea fi apoi indicativă a toxicității cardiovasculare (7).

Mayer și colab. (30), utilizând teste in vitro, au arătat că metaboliții de fază 4 4-metilcatinonă (nor-mefedronă (nor-MEPH) în continuare), 4-hidroxitolilmefedronă (4-OH-MEPH) și dihidromedefronă au, de asemenea, activitate măsurabilă la DAT, NET, și SERT, deși dintre acestea, numai nor-MEPH și 4-OH-MEPH într-un interval semnificativ pentru testele comportamentale. Prin urmare, metaboliții bioactivi pot contribui și la efectele MEPH. Cu toate acestea, acest lucru a fost confirmat anterior doar pentru nor-MEPH, care a prezentat activitate de stimulare a comportamentului in vivo (30).

La modelele de rozătoare, administrarea MEPH duce la creșteri ale dozei dependente de locomoție [revizuite în Ref. (7)]. Intensitatea și durata acestor modificări sunt comparabile cu cele observate după aceeași doză de MDMA, dar mai mică decât efectele amfetaminei (23, 24). Efectul MEPH asupra porții senzorimotorii a fost evaluat doar într-o paradigmă de administrare cronică de către Shortall și colab. (31); pentru a imita consumul recreativ de droguri de tip week-end, au administrat MEPH (1, 4 sau 10 mg/kg) de două ori pe săptămână în două zile consecutive timp de 3 săptămâni și au testat inhibarea prepulsei a reacției acustice de tresărire [PPI ASR; o operaționalizare comportamentală a porții senzorimotorii (32)]; 30 min (min) după injecția finală; acest lucru nu a produs niciun efect perturbator. Pe de altă parte, medicamentele asociate, cum ar fi MDMA, amfetamina, cocaina, de asemenea catinonă în sine și metilonă, au arătat unele efecte perturbatoare în această paradigmă (33-39). În prezent, nu există informații despre efectul acut al MEPH și nici efectele metaboliților săi asupra IPP.

Studiile efectelor MEPH asupra termoreglării sunt inconsistente în rezultatele lor; au fost documentate atât răspunsurile hipertermice (șobolanii Sprague-Dawley (24, 27)), cât și cele hipotermice (40). Modificarea temperaturii corpului este un efect care este dependent de doză și mediu în cazul MDMA și al compușilor înrudiți [de exemplu, Ref. (38, 39, 41, 42)]. În două dintre studiile noastre anterioare, am constatat că compușii serotoninergici, împreună cu hipertermia severă, pot induce transpirații profunde, în special atunci când șobolanii sunt adăpostiți în cuști în grupuri (38, 41). Locuința în grup imită condițiile aglomerate din cluburile în care se folosesc de obicei droguri, cum ar fi MDMA și MEPH. Se știe, în general, că hipertermia asociată cu utilizarea acestor compuși este una dintre condițiile cheie anterioare de neurotoxicitate, precum și de toxicitate somatică acută legată de sindromul serotoninei (43). Prin urmare, este necesară examinarea detaliată a interacțiunilor legate de doză cu condițiile de mediu (cum ar fi aglomerarea) pentru a elucida inconsecvențele efectelor MEPH asupra termoreglării.

Principala noastră intenție a fost să îmbogățim cunoștințele actuale despre MEPH printr-o descriere detaliată a caracteristicilor temporale ale efectelor sale comportamentale în raport cu farmacocinetica și bio-distribuția sa și să investigăm efectele principalului său metabolit activ nor-MEPH. Pentru a descrie profilul temporal al modificărilor comportamentale, au fost utilizate două testări (5 sau 40 min după administrarea medicamentului) pentru a înregistra atât efectele de vârf, cât și cele prelungite ale medicamentului. Efectele locomotorii stimulatoare, explorarea și/sau potențialul anxiogen/anxiolitic au fost testate în testul în câmp deschis (OFT) și efectele asupra porții senzorimotorii au fost măsurate în PPI ASR. Odată cu aceasta, s-a stabilit profilul farmacocinetic al MEPH și nor-MEPH în creier și ser și biodistribuția lor în ficat și plămâni, peste 8 ore. Pentru a evalua efectele MEPH asupra termoreglării în condiții de mediu aglomerate și izolate, temperaturile rectale au fost măsurate peste 8 ore în grupuri de cinci șobolani față de șobolani găzduiți singuri.

Materiale și metode

Animale

Șobolani masculi Wistar (VELAZ, Republica Cehă) cu o greutate de aproximativ 180-250 g au fost adăpostiți în perechi în condiții controlate (aranjament luminos/întunecat: 12/12 ore, temperatură: 22 ± 2 ° C, umiditate: 30-70%) cu apă ad libitum și dietă standard. În fiecare studiu, șobolanii s-au aclimatizat la instalația de laborator timp de șapte zile, cu teste efectuate în cele șapte zile următoare. Prin urmare, testarea/prelevarea de probe au avut loc atunci când șobolanii aveau aproximativ 10-11 săptămâni (adulți) și erau în laborator timp de aproximativ 10-14 zile în total. În timpul perioadei de aclimatizare, șobolanii au fost manipulați de patru ori și cântăriți de două ori. Experimentele și măsurătorile au fost efectuate în faza ușoară a ciclului (între orele 07:00 și 15:00). Grupurile experimentale au fost formate din 10 indivizi, fiecare șobolan a fost testat o singură dată, cu excepția faptului că pentru a reduce numărul de animale utilizate, șobolanii tratați prin MEPH/nor-MEPH în studiile comportamentale au fost ulterior utilizați pentru eșantionarea farmacocinetică. Prin urmare, au fost necesari doar opt șobolani suplimentari (pentru probe de 30 de minute după administrarea medicamentului).

Droguri și produse chimice

Mefedrona a fost cumpărată prin internet și ulterior purificată și convertită în clorhidrat de MEPH de Alfarma s.r.o. (Republica Cehă). MEPH rezultat a fost certificat pentru a avea o puritate de 99,18% (analizat prin spectroscopie în infraroșu) și a servit, de asemenea, ca standard de referință pentru analize farmacocinetice utilizând cromatografie lichidă. Nor-MEPH a fost sintetizat la Departamentul de Chimie Organică, Facultatea de Tehnologie Chimică (Universitatea de Chimie și Tehnologie din Praga, Republica Cehă) la o puritate de 99,18%. Standardele interne MEPH-D7.HCl și nor-MEPH-D7.HCl pentru testele cantitative de cromatografie lichidă/spectrometrie de masă (LC/MS) au fost sintetizate la Departamentul de Chimie Organică, Facultatea de Tehnologie Chimică, Universitatea de Chimie și Tehnologie din Praga, Cehia Republică). Coloanele de extracție (Bond Elut Certify 50 mg/3 ml) au fost furnizate de Labicom s.r.o., Olomouc. Alte substanțe chimice utilizate în scopuri de laborator au avut puritate analitică. MEPH a fost depozitat într-un loc uscat și întunecat și dizolvat în soluție salină fiziologică (0,9% NaCI) imediat înainte de experimente.

Dozare

Dozele pentru administrare subcutanată (sc.) Au fost estimate în raport cu cantitățile utilizate în mod obișnuit de oameni, raportat potența/afinitatea la transportori și pe baza studiilor noastre anterioare cu compuși înrudiți, în special MDMA, MDAI și catinonă metilonă inelară substituită (35), 38, 39, 44, 45). Mai mult, am stabilit aceste doze cu intenția de a imita doza comparabilă cu utilizarea umană și intermediară - doză mare cu efect acut puternic preconizat, dar toxicitate neletală. În cele din urmă, dozele au fost, de asemenea, ajustate în mod adecvat pentru diferențele între specii, în conformitate cu formula sugerată de Reagan-Shaw și colab. (46). Toate substanțele au fost dizolvate în vehicul (ser fiziologic 0,9%) la un volum de 2 ml/kg administrat sc. (pentru comparabilitate cu studiile noastre anterioare). Șobolanii utilizați pentru eșantionarea farmacocinetică au fost tratați cu MEPH 5 mg/kg. MEPH 5 sau 20 mg/kg a fost utilizat în studiul de monitorizare a temperaturii, iar MEPH 2,5, 5 sau 20 mg/kg și nor-MEPH 5 mg/kg au fost utilizate în testele comportamentale. Ca control al vehiculului (VEH), animalele au fost tratate cu un volum echivalent de 0,9% ser fiziologic.

Farmacocinetica

Pentru farmacocinetică, șobolanilor li s-a administrat MEPH (5 mg/kg sc.) Și ulterior decapitat după 30, 60, 120, 240 sau 480 min (n = 8/grup experimental). Serurile, creierul, ficatul și țesuturile pulmonare au fost colectate și depozitate la -20 ° C până la analiză.

Determinarea nivelurilor MEPH și Nor-MEPH în probe de ser și țesuturi utilizând LC/HRMS

Pretratarea serului

0,2 ml ser de șobolan a fost fortificat cu standardul intern MEPH-D7 și nor-MEPH-D7 în soluție metanolică (într-o cantitate față de nivelurile de MEPH/nor-MEPH din probele testate) și 0,5 ml de fosfat 0,1 M tampon (pH 6) într-un tub marcat.

Pretratarea țesuturilor

250 mg de țesut (creier, plămân, ficat) au fost omogenizate cu 5 ml de metanol și standardul intern MEPH-D7 și nor-MEPH-D7 (într-o cantitate față de nivelurile de MEPH/nor-MEPH din probe). Fiecare specimen a fost apoi ultrasunetat timp de 20 de minute și după separarea supernatantului prin centrifugare, supernatantul a fost transferat într-un tub etichetat curat și evaporat la sec. Reziduul a fost reconstituit în tampon fosfat 0,1 M (pH 6). Pentru extracția în fază solidă (SPE) a MEPH/nor-MEPH, o probă pretratată de ser sau țesut, împreună cu tamponul și standardul intern, a fost încărcată pe un cartuș Bond Elut Certify condiționat anterior cu 0,5 ml de tampon fosfat 0,1 M ( pH 6). După aplicarea fiecărei probe pretratate, cartușul a fost spălat cu 0,5 ml apă distilată, 0,5 ml HCI 0,1 M și 0,5 ml CH3OH/H2O (1/1, v/v) și apoi uscat la aer timp de 5 min. Analitele au fost eluate de trei ori cu 0,5 ml dintr-un amestec proaspăt preparat de diclormetan/2-propanol/hidroxid de amoniu (25%), 80/20/4, v/v/v. Eluatul a fost ușor evaporat până la uscare sub un curent de aer la 40 ° C și apoi dizolvat în fază mobilă pentru analiza LC/HRMS.

Condiții LC/HRMS

Analizele au fost efectuate folosind Dionex Ultimate 3000 UHPLC cuplat la un MS Exactive Plus-Orbitrap (ThermoFisher Scientific, Bremen, Germania) echipat cu o sursă HESI-II. Analizele cromatografice ale probelor de ser și țesut au fost efectuate folosind un Kinetex PFP 100 A (50 × 2,1 mm, 2,6 mm) și cartușul de protecție PFP 4 × 2,0 mm (Phenomenex) cu un debit de 400 ml/min și gradient eluare cu 10 mM formiat de amoniu în 0,1% acid formic ca fază mobilă B. Gradient 0 min 5%, 4 min 45% B, 5-6 min menținut la 95%. Condițiile MS au fost următoarele: MS completă în intervalul de scanare de 50-500 m/z cu ionizare electrospray pozitivă, rezoluție de 70000 FWHM (lățime completă la jumătate maximă, viteză de scanare 3 Hz), tensiune de pulverizare de 3 kV și o temperatura capilară de transfer ionic de 320 ° C.

Comportament: câmp deschis și PPI

Câmp deschis

OFT a fost efectuat în conformitate cu studiile noastre anterioare (38, 47). A fost folosită o arenă pătrată neagră goală (68 cm × 68 cm × 30 cm), care a fost practic împărțită într-o grilă de 5 × 5 de pătrate identice; 16 pătrate erau situate în apropierea zidurilor arenei (cuprinzând zona periferică), iar 9 pătrate erau situate central (cuprinzând zona centrală). Șobolanii au fost plasați individual în centrul arenei la 5 sau 40 de minute după administrarea medicamentului (testare-debut) și comportamentul lor a fost înregistrat timp de 30 de minute (șobolanii tratați cu nor-MEPH au fost testați doar la testarea de 5 minute). Software-ul EthoVision Color Pro v. 3.1.1 (Noldus, Olanda) a fost folosit pentru a captura datele brute utilizate la calcularea următoarelor variabile dependente: lungimea traiectoriei (cm; corectate pentru abateri de 2 niveluri sau interacțiuni semnificative, au fost efectuate comparații post-hoc pe perechi folosind Newman –Testele Keuls.

Date comportamentale (OFT și PPI)

Distribuția spațială a testului în câmp deschis (thigmotaxis și Tcenter) și parametrii PPI (obișnuință, ASR și PPI) au fost analizați fiecare utilizând un ANOVA factorial 2 × 4 cu debut de testare (5 sau 40 min) și tratament medicamentos (VEH sau MEPH 2.5, 5 și 20 mg/kg sc.) Ca între factori subiecți. În cazul efectelor principale semnificative asupra ASR sau a obișnuinței, factorul semnificativ a fost inclus ca o covariabilă în analiza ulterioară a datelor PPI (folosind ANCOVA). Modelul temporal al activității locomotorii în OFT (lungimea traiectoriei în blocuri de 5 min) a fost analizat folosind un ANOVA factorial mixt 2 × 4 × 6 cu debut de testare și tratament medicamentos între factorii subiecți și blocuri de timp (6 × 5 min) ca factor din cadrul subiecților.

Au fost analizate analize suplimentare pentru a compara potența nor-MEPH cu MEPH utilizând ANOVA unidirecțional cu cinci niveluri de tratament medicamentos (VEH sau nor-MEPH 5 mg/kg sau MEPH 2,5, 5 și 20 mg/kg sc.) factor între subiecți. Pentru OFT, modelul temporal al activității locomotorii a fost analizat folosind un ANOVA factorial mixt de 5 × 6 cu tratament medicamentos ca factor între subiecți și blocuri de timp de 5 min ca factor din cadrul subiecților. În această analiză au fost folosite doar datele de la debutul testării de 5 minute (deoarece datele pentru debutul testării de 40 de minute nu erau disponibile pentru toate tratamentele medicamentoase).

Temperatura corpului

Datele au fost analizate folosind un design factorial mixt de 3 × 2 × 13 cu tratament medicamentos (VEH sau MEPH 5 sau 20 mg/kg) și starea în cușcă la domiciliu (găzduit individual sau în grup) între factorii subiecți și timp (13 măsurători) ca în cadrul factorilor subiecți.

Rezultate

Farmacocinetica

Concentrația maximă medie serică de MEPH (826,2 ng/ml) a fost atinsă în decurs de 30 de minute. Influxul în creier nu a fost evident întârziat în comparație cu serul; concentrația medie maximă în țesutul cerebral (767 ng/g) a fost, de asemenea, atinsă la 30 de minute după doză. MEPH s-a acumulat robust în plămâni: concentrația la 30 min a fost de 1.044,5 ng/g, depășind concentrațiile în ser, creier și ficat. La patru ore după administrare, nivelurile din ser și din toate țesuturile erau aproape nedetectabile (Figura (Figura 1 1 A).

efecte

Mefedrona medie (MEPH) (A) și metabolitul său nor-mefedronă (B) niveluri în ser, creier, plămâni și ficat peste 6 ore după aplicarea MEPH 5 mg/kg sc. Barele de eroare afișează ± 1 SEM.

Media maximă a nor-MEPH (metabolizată din MEPH in vivo; amintim că nor-MEPH în sine nu a fost administrată în studiile farmacocinetice), concentrația serică de 351,9 ng/ml a fost atinsă în decurs de 1 oră de tratament. Concentrația medie maximă în creier (197,1 ng/g) a fost, de asemenea, evidentă la 30 de minute. Nor-MEPH acumulat în țesutul pulmonar cu o concentrație medie maximă de 382,9 ng/g observată la 30 min. La șase ore după administrare, nor-MEPH a fost doar puțin peste nivelul de detectare în toate țesuturile și plasma (Figura (Figura 1.1 B).

Raportul mediu creier: ser a fost 1: 1,19 pentru MEPH și 1: 1,91 pentru nor-MEPH pe parcursul întregii observații temporale.

Comportament

Test de câmp deschis

Analiza locomoției a relevat un efect principal al tratamentului medicamentos [F (3, 72) = 24,754, p (Figura 2A). 2 A). La debutul testării de 40 de minute, activitatea crescută nu a mai fost prezentă (p> 0,05), deși șobolanii au prezentat încă obișnuință locomotorie normală (Figura (Figura 2B). 2 B). O analiză suplimentară a locomoției totale, inclusiv nor-MEPH (test de 5 min-debut), a confirmat un efect principal semnificativ al tratamentului medicamentos [F (4, 45) = 27.699, p (Figura 2A). 2 A). Pentru modele tipice de traiectorie induse de tratamente, a se vedea Figura Figura 2 2 C.