Nicolas Dumont

De la Centre Hospitalier Universitaire de Quebec - Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université Laval, * și Département de Réadaptation, † Faculté de Médecine, Université Laval, Quebec City, Quebec, Canada

Jérôme Frenette

De la Centre Hospitalier Universitaire de Quebec - Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université Laval, * și Département de Réadaptation, † Faculté de Médecine, Université Laval, Quebec City, Quebec, Canada

Abstract

Monocitele sunt celule mononucleare mari care circulă în sânge și se diferențiază în macrofage în țesuturile invadate ca răspuns la diferiți stimuli. 1 Macrofagele au o capacitate fagocitară puternică și pot orchestra procesul inflamator prin eliberarea unei largi varietăți de citokine și chemokine, cum ar fi interleukina (IL) -1, factorul de necroză tumorală-α și proteina inflamatorie a macrofagelor-2. 2, 3 Numeroase studii au demonstrat, de asemenea, că macrofagele joacă un rol direct în recuperarea țesuturilor prin eliberarea de molecule antiinflamatorii și factori de creștere anabolici IL-10, factor de bază de creștere a fibroblastelor și factor de creștere asemănător insulinei (IGF-1) ). 4, 5, 6

În studiul de față, șoarecii săraci în macrofage au fost supuși descărcării și reîncărcării membrelor posterioare pentru a evalua rolul macrofagelor în atrofia și regresul muscular. Rezultatele noastre au arătat că macrofagele nu previn pierderea forței musculare și nici nu favorizează recuperarea în timpul fazei inflamatorii timpurii (1 și 3 zile după reîncărcare). Cu toate acestea, ele joacă un rol cheie în creșterea și recuperarea musculară în perioade ulterioare (7 și 14 zile după reîncărcare). În plus, un model de cocultură in vitro în care miotuburile atrofiate au fost combinate cu macrofage care exprimă un fenotip antiinflamator a arătat că prezența macrofagelor protejează miotuburile de atrofie și că acest efect protector este parțial mediat de eliberarea IGF-1.

Materiale și metode

Animale

Șoarecilor masculi C57BL/6 (22 până la 24 g) de la Charles River (St-Constant, QC, Canada) li s-a dat apă și alimente ad libitum și au fost adăpostiți cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Șoarecii experimentali au fost supuși descărcării membrelor posterioare timp de 10 zile folosind o modificare a tehnicii dezvoltate de Morey-Holton și Globus. 17 Membrele posterioare au fost apoi reîncărcate timp de 0, 3, 7 sau 14 zile. Șoarecii ambulatori au fost folosiți ca martori. Șoarecii au fost eutanasiați prin luxație cervicală sub anestezie. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Centrului de cercetare universitar Laval, pe baza ghidurilor Consiliului canadian pentru îngrijirea animalelor.

Epuizarea monocitelor/macrofagelor

Pentru a determina rolurile specifice ale monocitelor/macrofagelor în recuperarea musculară după atrofie, etopozidul (VP-16, Sigma, St. Louis, MO) diluat în dimetil sulfoxid (15 mg/kg de masă de șoarece) a fost injectat zilnic timp de 3 zile înainte de reîncărcare până la sfârșitul protocolului experimental. Etopozidul acționează ca un inhibitor al topoizomerazei II și este utilizat în tratamentul unor afecțiuni maligne, cum ar fi leucemia nelimfocitară, pentru a inhiba proliferarea celulelor albe din sânge. 18 șoareci placebo au primit zilnic injecții de dimetil sulfoxid. Efectele etopozidului asupra numărului de leucocite au fost confirmate prin citometrie în flux așa cum s-a descris anterior. 14 Pe scurt, sângele a fost colectat prin puncție cardiacă, incubat cu IgG de șobolan blocant (Sigma) și marcat cu 0,2 mg de șobolan anti-șoarece Ly-6G anticorp conjugat R-ficoeritrin sau 0,4 mg de șobolan anti-șoarece F4/80 Anticorpi conjugați cu R-ficoeritrin (anticorpi primari, BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ) pentru a detecta neutrofilele și respectiv macrofagele. IgG anti-șoarece de șobolan conjugat cu R-ficoeritrină a fost utilizat ca anticorp martor izotip la aceleași concentrații (BD Pharmingen). Citometria de flux a fost efectuată folosind un citometru de flux EPICS XL (Beckman-Coulter, Fullerton, CA).

Proprietăți contractile izometrice

Șoarecii au fost injectați i.p. cu buprenorfină (0,1 mg/kg) ca analgezic și anesteziat cu pentobarbital sodic (50 mg/kg) 15 minute mai târziu. 19 Mușchii solei drepți au fost disecați cu atenție, atașați la un electrod și incubați într-o soluție de sare fiziologică tamponată (Krebs-Ringer) suplimentată cu glucoză (2 mg/ml) pentru măsurători absolute și specifice ale forței musculare, așa cum a fost descris anterior. 14, 20 Forța musculară absolută reprezintă forța totală generată de mușchi, în timp ce forța musculară specifică contează și masa musculară și lungimea fibrelor. Ulterior, lungimea mușchilor a fost măsurată, tendoanele au fost îndepărtate și mușchii au fost cântăriți. Mușchii au fost apoi încorporați în mediu de înghețare a țesuturilor (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC), înghețat în izopentan (2-metilbutan, Sigma) răcit în azot lichid și depozitat la -80 ° C până la utilizare.

Imunohistochimie și numărare celulară

Secțiunile transversale (10 μm) ale mușchilor soleului au fost tăiate (criostat CM1850, Leica Microsystems, Nussloch, Germania) la -20 ° C și au aderat la lamele Snowcoat X-tra (Surgipath, Richmond, IL). După 1 oră într-un tampon de blocare, secțiunile au fost incubate timp de 2 ore cu anticorp F4/80 anti-șoarece de șobolan (Serotec, Oxford, Marea Britanie) pentru a identifica macrofage sau anticorp Ly-6G/Ly-6C anti-șoarece de șobolan (RB6- 8C5, BD Pharmingen) pentru identificarea neutrofilelor. Secțiunile au fost apoi incubate cu IgG biotinilat anti-șobolan de iepure (anticorp secundar, Vector Laboratories, Burlingame, CA) timp de 1 oră. În cele din urmă, secțiunile au fost incubate timp de 30 de minute cu hrean peroxidază avidină D (Vector Laboratories) și au fost dezvăluite folosind diaminobenzidină cromogen (DakoCytomation, Carpinteria, CA). Fiecare secțiune a fost examinată prin microscopie cu lumină la o mărire de × 400, iar numărul de celule marcate în întreaga secțiune a fost determinat și exprimat pe mm2. Numărul de celule inflamatorii a fost măsurat în dublu exemplar pe două secțiuni ale abdomenului mijlociu, atât din mușchii solei stâng cât și din cel drept. Pentru analizele statistice s-au folosit medii de patru secțiuni pe șoarece pe anticorp.

Cultura celulară și atrofia Myotube

Coculturi Macrofage/Myotube

Analiza diametrului Myotube

Diametrele miotubului au fost măsurate prin microscopie cu lumină la × 100 (Nikon, Tokyo, Japonia). Trei situri diferite din fiecare godeu au fost identificate și observate orbește pe tot parcursul experimentului. Diametrele miotuburilor au fost cuantificate utilizând sistemul de imagistică digitală ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Pentru fiecare miotub, s-a obținut o primă măsurare a lățimii la 50 μm distanță de marginea miotubului și la fiecare 200 μm ulterior. Această metodă a permis de obicei înregistrarea a două sau trei măsurători pentru fiecare miotub, iar media a fost considerată ca o singură valoare. S-au măsurat diametrele de 150 până la 200 de miotuburi pe godeu.

Conținutul de proteine ​​și Western Blots

Analize statistice

Toate valorile sunt raportate ca medii ± SEM. Datele au fost analizate printr-o analiză unidirecțională a varianței pentru a determina dacă variațiile dintre grupurile experimentale au fost semnificative (JMP). Când s-a obținut un raport F semnificativ, s-a efectuat o comparație multiplă post hoc folosind testul diferențelor mai puțin semnificative protejate de Tukey pentru a determina dacă au apărut diferențe specifice. Nivelul de semnificație a fost stabilit la P (Figura 1A). Cu toate acestea, numărul macrofagelor din mușchii soleului a fost comparabil cu cel de la șoarecii placebo în ziua 7 după reîncărcare. Deși etopozidul a scăzut ușor numărul de neutrofile circulante, numărul neutrofilelor infiltrate nu s-a modificat în timpul diferitelor perioade de reîncărcare, cu excepția zilei 7 când s-a observat o creștere de 2 ori în grupul cu etopozide reîncărcat comparativ cu grupul placebo reîncărcat (Figura 1B ) .

atrofiei

Identificarea fenotipului macrofagelor utilizând expresia proteinei COX-2. Nivelul proteinei COX-2 a fost determinat prin Western blot de proteine ​​extrase din macrofage singure (martor negativ), macrofage care conțin neutrofile apoptotice și macrofage incubate cu lipopolizaharidă (LPS; 200 ng/ml) (martor pozitiv). Banda COX-2 are o masă moleculară de aproximativ 72 kDa. Gliceraldehida-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) a fost utilizată ca marker de încărcare a proteinelor și are o masă moleculară de aproximativ 37 kDa.

A: Diametrele și lungimea miotubului în mono- și coculturi după atrofie miotubă indusă de ser redusă și neutralizare IGF-1. Diametre miotub (A) și lungimea (B) au fost măsurate în monoculturi de miotub, miotuburi coculturate cu macrofage, miotuburi incubate cu anti-IGF-1 și miotuburi coculturate cu macrofage și anti-IGF-1. Valorile sunt exprimate ca medii ± SEM (n = 12 în ziua 1 și n = 6 în ziua 2). Semnificativ diferit de monoculturile de miotub, * P 27, 28, 29 Numărul mare de macrofage la locurile de leziune în timpul rezoluției reacției inflamatorii și începutul fazei de reparare și capacitatea lor de a trece de la un fenotip proinflamator la un antiinflamator fă-i un candidat excelent pentru promovarea reparației și creșterii musculare. 30, 31 În prezentul articol, am demonstrat că macrofagele joacă un rol critic în recuperarea forței musculare după atrofia musculară. De asemenea, am arătat, folosind un sistem de cocultură macrofagă/miotub, că IGF-1 eliberat de macrofage protejează împotriva atrofiei miotubului și scăderii conținutului de lanț greu al miozinei.

Descoperirile prezente se adaugă numărului tot mai mare de studii care demonstrează că macrofagele au efecte benefice asupra recuperării mușchilor cauzate de diverse leziuni și dezafectări. 27, 51, 57, 58, 59 Am arătat pentru prima dată că macrofagele joacă un rol critic la nivel funcțional în recuperarea musculară după atrofie. De asemenea, am demonstrat, folosind un sistem de cocultură, că IGF-1 este parțial responsabil pentru capacitatea macrofagelor de a proteja miotuburile de atrofie. Va fi interesant să se determine rolul altor factori implicați în acest efect pozitiv. În cele din urmă, rezultatele actuale sugerează, de asemenea, în mod indirect, că prescripțiile anti-inflamatorii trebuie utilizate cu circumspecție din cauza efectelor pozitive ale diferitelor subpopulații de macrofage în timpul reparării și creșterii musculare.

Note de subsol

Adresa solicitări de reimprimare către Jérôme Frenette, P.T., Ph.D., CHUQ-CRCHUL, 2705 Boulevard Laurier, T-R-93, Quebec City, QC, Canada G1V 4G2. E-mail: [email protected].

Susținut de subvenții de la Institutele canadiene de cercetare în domeniul sănătății și Consiliul de cercetare în științe naturale și inginerie din Canada.