Centrul de afiliere Waisman, Universitatea din Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, Statele Unite ale Americii

litiul

Centrul de afiliere Waisman, Universitatea din Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, Statele Unite ale Americii

Centrul de afiliere Waisman, Universitatea din Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru neurologie, Universitatea din Bonn, Bonn, Germania

Centrul de afiliere Waisman, Universitatea din Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru neurologie, Universitatea din Bonn, Bonn, Germania

Afilieri Waisman Center, Universitatea din Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Biosciences Comparative, Universitatea din Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, Statele Unite ale Americii

  • Christine M. LaPash Daniels,
  • Elizabeth Paffenroth,
  • Elizabeth V. Austin,
  • Konstantin Glebov,
  • Diana Lewis,
  • Jochen Walter,
  • Albee Messing

Cifre

Abstract

Citare: LaPash Daniels CM, Paffenroth E, Austin EV, Glebov K, Lewis D, Walter J, și colab. (2015) Litiul scade proteina acidă fibrilară glială într-un model de șoarece al bolii Alexander. PLoS ONE 10 (9): e0138132. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0138132

Editor: David R. Borchelt, Universitatea din Florida, STATELE UNITE

Primit: 21 iunie 2015; Admis: 25 august 2015; Publicat: 17 septembrie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante sunt conținute în hârtie și în fișierele sale de informații suport.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de subvenții de la Institutul Național de Tulburări Neurologice și Accident vascular cerebral (ninds.nih.gov; NS060120 și NS042803 la AM), Institutul Național pentru Sănătatea Copilului și Dezvoltarea Umană (nichd.nih.gov; P30 HD003352 la Waisman Center), și Fondul Juanma (AM). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Boala Alexander este o boală neurodegenerativă rară și fatală caracterizată prin formarea incluziunilor de proteine, numite fibre Rosenthal, în corpurile și procesele celulelor astrocitelor. Aproape toate cazurile sunt asociate cu mutații dominante în proteina acidă fibrilară glială a filamentului intermediar (GFAP) [1], care par să acționeze într-un mod de câștig de funcție. Debutul poate apărea pe tot parcursul vieții, cu simptome precum convulsii și întârzieri psihomotorii în dezvoltare frecvente la pacienții mai tineri și dificultăți de vorbire și înghițire, disfuncție autonomă și tulburări de mers mai frecvente la pacienții vârstnici [2]. Boala Alexander este clasificată printre leucodistrofii datorită defectelor proeminente ale substanței albe prezente, în special la pacienții cu debut precoce.

În timp ce întrebarea dacă fibrele Rosenthal în sine sunt toxice este nerezolvată, o ipoteză principală pentru a explica patogeneza este că nivelurile de proteine ​​GFAP se acumulează peste un prag toxic (încă nedefinit), ducând la disfuncția astrocitelor și la pletora efectelor secundare asupra altor tipuri sistemul nervos central [3]. Într-adevăr, creșterile GFAP se găsesc în mod constant în boala Alexander, atât atunci când sunt măsurate în parenchimul creierului, cât și în LCR [4, 5]. GFAP este o componentă majoră a fibrelor Rosenthal și, de fapt, formarea fibrelor Rosenthal poate fi inițiată pur și simplu prin supraexprimarea chiar a GFAP de tip sălbatic la niveluri suficient de ridicate [6]. Acumularea de GFAP care se găsește în boala Alexander rezultă în parte din sinteza crescută, deoarece nivelurile de ARNm sunt crescute [7] și există o creștere spontană a activității promotorului GFAP [8]. În plus, schimbări complexe apar în căile de degradare. De exemplu, GFAP mutant al bolii Alexander activează un răspuns la stres c-Jun N-terminal kinază (JNK) care blochează activitatea proteazomului [9, 10]. Împreună, modificările sintezei și degradării ar putea duce la bucle de feedback pozitiv care exacerbează acumularea de GFAP.

Reducerea acumulării GFAP sub nivelurile toxice a fost propusă ca o strategie potențială pentru tratament [11]. Considerând căile de degradare ca țintă terapeutică, o posibilitate de reducere a agregării proteinelor este inducerea autofagiei. Autofagia (macro-autofagia) este o cale de degradare nespecifică pentru proteinele citoplasmatice de lungă durată, complexele de proteine ​​și organite [12]. Medicamentele care induc autofagii s-au dovedit utile pentru scăderea agregatelor de proteine ​​în modele ale altor tulburări neurodegenerative, cum ar fi boala Huntington, boala Parkinson, ataxia spinocerebeloasă și tauopatia [13-17]. Într-adevăr, bazându-se în mare parte pe modele de cultură celulară, autofagia pare a fi crescută în mod natural la pacienții cu boală Alexander, iar autofagia contribuie la degradarea GFAP [4]. Am emis ipoteza că creșterea autofagiei în continuare în boala Alexander ar putea reduce nivelurile de proteine.

Litiul poate inhiba GSK3β direct, prin concurență cu Mg ++ și indirect prin Akt/PKB. Inhibarea GSK3β are loc prin fosforilare (P) la Serina 9 (S9). Dezinhibarea mTOR poate duce apoi la o scădere a autofagiei. Litiul poate crește, de asemenea, autofagia prin calea IMPase. Alternativ, litiul poate inhiba STAT3 direct sau indirect prin GSK3β, prin scăderea fosforilării sale la tirozină 705 (Y705). STAT3 este apoi împiedicat să se transloce către nucleu unde s-ar lega în mod normal la promotorul GFAP și ar activa transcripția. Textul roșu indică inhibarea, iar textul albastru indică activarea căilor de către litiu.

Datorită efectelor sale raportate asupra autofagiei, STAT3 și GFAP, am încercat să testăm dacă litiul ar putea scădea nivelul GFAP într-un model de șoarece al bolii Alexander. Șoarecii knock-in Gfap-R236H au o mutație omologă mutației comune R239H la om și reproduc mai multe caracteristici ale bolii, inclusiv GFAP crescut, fibrele Rosenthal, un răspuns crescut la stres și o susceptibilitate crescută la convulsii [26]. Am constatat că tratamentul cu litiu a scăzut proteina GFAP și transcrierile în mai multe regiuni ale creierului și măduvei spinării la șoareci mutanți Gfap, deși cu efecte secundare și decese care au fost dependente de doză. Markerii pentru autofagie au fost neschimbați, deși a existat o activare diminuată a STAT3, indicând faptul că litiul poate scădea nivelurile de GFAP prin reglarea transcripțională mai degrabă decât prin căile de degradare a proteinelor.

Materiale și metode

Declarație de etică

Toate studiile au fost efectuate în conformitate cu recomandările Ghidului Institutului Național de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator și au fost aprobate de Comitetul pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de la Școala Absolventă de la Universitatea din Wisconsin-Madison (protocoalele G00199, G00321, și G00549).

Șoarecii knock-in cu mutația punctuală Gfap-R236H au fost generați așa cum s-a descris anterior [26] și au fost menținuți ca heterozigoți în fundalul FVB/N așa cum s-a descris anterior [27]. Șoarecii transgenici Gfap-luc exprimă luciferaza licurică sub controlul a 12 kb al promotorului Gfap de șoarece [28] și au fost, de asemenea, menținuți în fundalul FVB/N. Șoarecii au fost adăpostiți pe un ciclu de întuneric/lumină de 10 h/14 h cu 2-5 șoareci pe cușcă. Șoareci R236H/+ bărbați și femele și +/+ tovarăși au fost folosiți pentru experimente și datele de la fiecare sex au fost analizate separat, cu excepția cazului în care se indică altfel. S-au încercat cercetătorii orbi pentru tratamentul medicamentos, dar din cauza urinării crescute și a altor efecte secundare ușoare cauzate de LiCl, a devenit evident ce șoareci primeau LiCl și nu s-au făcut eforturi suplimentare pentru a continua „orbirea” studiilor. Șoarecii au fost tratați în ordine crescătoare a numărului de identificare, șoarecii mai tineri având numere de identificare mai mari (cele mai noi litiere au fost tratate ultima dată). Toate prelucrarea probelor și analiza inițială a datelor au fost făcute fără cunoștințe despre genotipul sau tratamentul medicamentos. În timpul tuturor studiilor, șoarecii au fost monitorizați cel puțin o dată pe zi. Șoarecii care s-au dovedit a fi inactivi și incapabili să acceseze cu ușurință alimentele sau apa au fost eutanasiați.

Tratamentul cu litiu prin injecție intraperitoneală

După genotipare, șoarecii masculi și femele au fost repartizați aleatoriu în grupurile de tratament cu litiu sau vehicul. O singură cușcă ar putea conține șoareci din oricare sau din toate cele 4 grupuri experimentale (+/+ vehicul, +/+ LiCl, vehicul R236H/+ și R236H/+ LiCl). Începând cu vârsta de 6 săptămâni, șoarecii au fost injectați intraperitoneal (ip) la aproximativ aceeași oră în fiecare zi timp de 30 de zile cu o soluție LiCl 0,6 M (Sigma, St. Louis, MO, SUA) diluată în soluție salină tamponată cu fosfat la o doză de 6 mmol/kg (10 μL la 10 g șoarece) pe baza unui protocol de la Noble și colab. [16]. Șoarecii de control ai vehiculului au primit injecții cu PBS. Șoarecii au fost cântăriți zilnic în momentul injectării. În plus față de sticla de apă normală, cuștile conțineau o sticlă suplimentară de 450 mM NaCl pentru a ajuta la prevenirea dezechilibrelor electrolitice care ar putea apărea la tratamentul cu litiu.

Tratament cu litiu prin 0,3% pelete alimentare LiCl

Șoarecii femele au fost repartizați aleatoriu în grupurile de tratament cu dietă de litiu sau de control și găzduiți în 4 cuști mari (2 pentru litiu, 2 pentru dieta de control) cu până la 10 șoareci din ambele genotipuri în fiecare cușcă. Începând cu vârsta de 6 săptămâni, șoarecii au fost hrăniți cu pelete de rozătoare (LabDiet 5015) conținând 0,3% LiCl, pe baza unui protocol de la Tajes și colab. [29]. LiCl a fost adăugat la pelete de Teklad Diets, Harlan Laboratories, Inc. Șoarecii de dietă de control au primit pelete LabDiet 5015 fără LiCl. Dieta de control și șoarecii cu litiu au primit o sticlă suplimentară de NaCl 450 mM în timpul tratamentului.

Tratament cu litiu prin 0,5% sau 0,7% pelete alimentare LiCl

Cuștile întregi de 2-5 șoareci au fost repartizate aleatoriu în grupurile de tratament cu litiu sau dietă de control [30, 31]. O singură cușcă ar putea conține șoareci cu unul sau ambele genotipuri (+/+ și R236H/+). Începând cu vârsta de 6 săptămâni, șoarecii au fost hrăniți cu pelete (LabDiet 5015) conținând 0,2% LiCl timp de 1 săptămână, urmat de 0,5% LiCl timp de 3 săptămâni (4 săptămâni tratament LiCl total) sau 7 săptămâni (8 săptămâni tratament LiCl total) pe baza un protocol de la Bersudsky și colab. [32]. Pentru tratamentul cu LiCl 0,7%, șoareci vechi de 6 săptămâni au fost hrăniți cu pelete conținând LiCl 0,2% timp de 1 săptămână, urmat de LiCl 0,7% timp de 3 săptămâni (tratament LiCI total cu 4 săptămâni). Șoarecii de dietă de control au primit pelete LabDiet 5015 fără LiCl pentru întreaga perioadă de tratament. Dieta de control și șoarecii cu litiu au primit o sticlă suplimentară de NaCl 450 mM în timpul tratamentelor. Șoarecii au fost cântăriți săptămânal.

Colectarea sângelui și măsurarea litiului

Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran și sângele colectat din vasele axilare. Șoarecii au fost decapitați și creierul colectat așa cum este descris mai jos. Sângele a fost lăsat să se coaguleze timp de 2 ore la temperatura camerei, centrifugat la 2.000 x g timp de 10 min și serul (supernatantul) a fost depozitat la -80 ° C. După ce s-a colectat sânge de la toți șoarecii într-un experiment, au fost alese aleatoriu 3-4 cuști pentru fiecare grup experimental și cel puțin o probă de ser de șoarece de la fiecare dintre aceste cuști a fost selectată aleatoriu pentru analiză. Dacă s-a folosit mai mult de o probă de șoarece pentru fiecare cușcă, valorile respective au fost calculate mai întâi înaintea medierii cu alte probe. Concentrația Li a fost măsurată utilizând spectrometria de absorbție atomică a flăcării la Laboratorul de igienă de stat din Wisconsin.

Colecția de țesuturi

Șoarecii au fost anesteziați și decapitați (așa cum s-a descris mai sus) sau sacrificați cu CO2. Creierele au fost îndepărtate și disecate în PBS rece ca gheața în emisfere și apoi în regiuni, astfel încât eșantioanele regionale provin dintr-o jumătate din fiecare creier. Regiunile specifice colectate au inclus bulbul olfactiv, corpul calos, hipocampul, cortexul cerebral deasupra hipocampului și substanța albă subiacentă (prescurtată ca „cortex”), cerebelul, trunchiul cerebral și măduva spinării cervicală (inclusiv segmentele 1-3). Aceste regiuni au fost selectate pe baza studiilor anterioare efectuate la șoareci, care prezintă locații ale patologiei proeminente (bulb olfactiv, hipocamp și corp calos) [26] și pe baza zonelor de implicare comună în cazurile de boală Alexander umană (substanță albă, trunchi cerebral și coloana vertebrală cervicală) cordon) [3]. Țesuturile au fost imediat înghețate în azot lichid și depozitate la -80 ° C până la o analiză ulterioară.

PCR cantitativă

GFAP ELISA

ELISA au fost efectuate pentru a cuantifica GFAP în țesuturi, așa cum s-a descris anterior [27]. Pe scurt, țesuturile au fost omogenizate în 3,5 ml (emisfera creierului), 0,4 ml (bulb olfactiv, corp calos, hipocamp, cortex, măduva spinării cervicală) sau 0,8 ml (trunchi cerebral, cerebel) 2% dodecil sulfat de sodiu (SDS), 50 mM Tris (pH 7,4), 5 mM EDTA (pH 7,4), 1X cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics Corp.) și 1 mM Pefabloc (Sigma) folosind un Geno/Grinder, apoi fierte timp de 15 min. Concentrația totală de proteine ​​a fost măsurată folosind kitul Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). Pentru țesuturi, probele și standardele GFAP au fost diluate în PBS cu 0,5% Triton-X și 1% BSA. Pentru sandwich ELISA, plăcile au fost acoperite cu SMI-26 (1: 1000, cocktail monoclonal anti-GFAP, Covance), blocate cu lapte uscat fără grăsimi 5%, incubate cu probe și standarde, apoi incubate cu iepure policlonale anti-vacă GFAP (1: 5000; Z0334, Dako), urmat de capra anti-iepure-HRP (1: 10.000), apoi SuperSignal ELISA Femto Substrat de sensibilitate maximă (Thermo Fisher Scientific). Chimioluminiscența a fost măsurată pe un luminometru cu microplacă GloRunner (Turner Biosystems).

Testul luciferazei pentru activitatea promotorului Gfap

Testele de luciferază au fost efectuate folosind țesuturi de la șoareci Gfap-luc-pozitivi R236H/+ și +/+ folosind sistemul ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega Corporation) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, țesuturile au fost omogenizate în 300 μl (bulb olfactiv, corp calos, hipocamp, cortex, măduva spinării cervicală) sau 500 μL (tulpină cerebrală, cerebel) de tampon Glo-Lysis timp de 4 minute la 1750 rpm folosind un Geno/Grinder și centrifugat la 1.370 xg timp de 20 minute la 4 ° C. 40 μL de supernatant a fost amestecat cu 40 μL de substrat de luciferază, incubat timp de 3 minute și luminiscența a fost măsurată pe un luminometru cu microplacă GloRunner. Luminiscența a fost normalizată la concentrația totală de proteine ​​măsurată folosind kitul Pierce BCA Protein Assay.

Imunobloti

analize statistice

Pentru greutatea corporală, ELISA și activitatea promotorului Gfap în experimentele LiCl de 0,5% și 0,7%, cuștile au fost considerate unitatea de analiză, astfel încât șoarecii cu același genotip într-o cușcă au fost mediatizați pentru a produce un singur punct de date [30, 31 ]. Rezultatele din mai multe cuști au fost apoi mediate pentru a produce medii și erori standard (SEM). Numărul de șoareci și cuști este specificat în secțiunea Rezultate. Comparațiile între cele patru grupuri experimentale s-au făcut folosind ANOVA unidirecțional cu teste t post Bonferroni pentru 4 comparații selectate (+/+ dietă de control față de +/+ LiCl, R236H/+ dietă de control vs. R236H/+ LiCl, +/+ dieta de control vs. R236H/+ dieta de control și +/+ dieta de control vs. R236H/+ LiCl). Datorită limitării spațiului, numai probe dintr-o singură regiune cerebrală ar putea fi rulate pe fiecare ELISA, testul luciferazei sau placa cu 96 de godeuri qPCR. Deoarece apare o anumită variabilitate între plăci, nu au fost făcute comparații statistice între regiunile creierului. Pentru analiza greutății corporale, comparațiile statistice au fost făcute numai în momentul final al fiecărui experiment. Nivelul de semnificație a fost definit ca 0,05 și * P Fig 2. LiCl administrat prin granule de LiCl 0,5% pentru 4 săptămâni scade nivelurile de GFAP la șoarecii Gfap-R236H/+.

(A) Analiza supraviețuirii pentru șoareci tratați cu 0,5% LiCl în pelete alimentare timp de 4 săptămâni. 94,7% (36/38) șoareci R236H/+ au supraviețuit tratamentului LiCl în timp ce 100% șoareci din alte grupuri au supraviețuit. (B) Concentrații de litiu în ser la sfârșitul tratamentelor de 4 sau 8 săptămâni (N = 3 cuști, 4 șoareci pe genotip pentru 4 săptămâni și N = 3 cuști, 3-4 șoareci pe genotip pentru 8 săptămâni). (C) Șoarecii masculi tratați cu LiCl +/+ și R236H/+ au avut greutăți corporale mai mici comparativ cu șoarecii tratați cu control (N = 3-5 cuști, 5-9 șoareci per grup). (D) Tratamentul cu LiCl 0,5% a scăzut GFAP în bulb olfactiv, hipocamp, cortex parietal, inclusiv substanță albă subiacentă (cortex) și măduva spinării cervicală a șoarecilor masculi R236H/+ măsurați prin ELISA (N = 3-5 cuști, 5-9 șoareci pe grup). (E) 0,5% tratament cu LiCl a scăzut nivelul transcripției Gfap în raport cu Tbp în toate regiunile, cu excepția cerebelului șoarecilor masculi R236H/+ (N = 4-5 șoareci per grup). Barele de eroare sunt SEM în B-D și SD în E. **** P Fig 3. LiCl administrat prin granule LiCl de 0,5% pentru 8 săptămâni scade nivelurile de GFAP la șoarecii Gfap-R236H/+ supraviețuitori.

(A) 81,8% (9/11) șoareci +/+ și 54,5% (6/11) șoareci R236H/+ au supraviețuit 8 săptămâni de tratament LiCl. Toți șoarecii au supraviețuit tratamentului de control al dietei. (B) Șoarecii masculi tratați cu LiCl +/+ și R236H/+ au avut greutăți corporale mai mici comparativ cu șoarecii tratați cu control (N = 4-6 cuști, 6-11 șoareci per grup). (C) Tratamentul cu LiCl 0,5% a scăzut GFAP în corpul calos, cortexul parietal incluzând substanța albă subiacentă (cortex), trunchiul cerebral, cerebel și măduva spinării cervicală a șoarecilor masculi R236H/+, măsurată prin ELISA (N = 3-4 cuști, 4-6 șoareci pe grup). (D) 0,5% LiCl a scăzut activitatea promotorului Gfap în hipocamp, cortex, trunchi cerebral, cerebel și măduva spinării cervicală de R236H/+; Șoareci Gfap-luc (N = 3-5 cuști, 4-5 șoareci per grup). Barele de eroare sunt SEM. **** P Fig 4. LiCl administrat prin granule alimentare LiCl 0,5% timp de 4 săptămâni scade răspunsul la stres antioxidant.

(A) LiCl scade transcrierile Nrf2 în hipocampus și cortexul șoarecilor R236H/+ (N = 5 șoareci masculi pe grup). (B) LiCl scade nivelurile de transcripție Nqo1 în hipocampus și cortexul șoarecilor R236H/+ (N = 4-5 șoareci masculi pe grup). Barele de eroare sunt SD. Datele sunt normalizate la 18S. **** P Fig 5. LiCl administrat prin granule alimentare LiCl 0,5% timp de 4 săptămâni nu mărește markerii pentru autofagie la șoarecii Gfap-R236H/+.

Fiecare bandă a imunoblotilor este țesut de la un șoarece. Imunoblotii pentru LC3-I și LC3-II din (A) nu au detectat o modificare a cortexului parietal (și a substanței albe subiacente) cu tratamentul cu LiCl. Benzile LC3-II normalizate la LC3-I sunt cuantificate în B (N = 3-4 șoareci din 3-4 cuști pe genotip și sunt reprezentative pentru 3 pete). LC3-II normalizat la GAPDH a dat rezultate similare și nu este prezentat. P62 a fost crescut în dieta de control R236H/+ bulb olfactiv de șoarece comparativ cu dieta de control +/+, dar LiCl nu a modificat nivelurile de P62 la șoarecii GFAP +/+ sau R236H/+ (C-D). P62 a fost normalizat la proteina totală încărcată. Barele de eroare sunt SEM. **** P Fig 6. LiCl administrat prin granule alimentare LiCl 0,5% timp de 4 săptămâni scade nivelurile pY705-STAT3 (pSTAT3) la șoarecii GFAP-R236H/+.