• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

Editat de Jeffrey M. Friedman, Universitatea Rockefeller, New York, NY și aprobat pe 12 mai 2006 (primit pentru revizuire 29 august 2005)

gena

Abstract

Hormonul proteic leptina este o citokină de tip I secretată de adipocite care acționează asupra SNC pentru a regla aportul alimentar și metabolismul (1, 2). În plus față de reglarea greutății corporale, leptina influențează reproducerea, creșterea, răspunsurile la stres și funcția tiroidiană (3, 4). Acțiunile leptinei sunt atât acute, cât și cronice. De exemplu, creșterile postprandiale ale leptinei plasmatice inhibă consumul de alimente, în timp ce concentrațiile medii zilnice de leptină plasmatică comunică starea energetică pe termen lung creierului (5). Aceste acțiuni sunt mediate de receptorii de leptină membranară (LR), dintre care șase izoforme au fost identificate la mamifere (6). Legarea leptinei de forma lungă a LR (LRb) activează transductorul de semnal Janus kinase 2/și activatorul căii de semnalizare a transcripției 3 (STAT-3) (7), care mediază efectele leptinei asupra consumului de alimente, metabolismul glucozei și creșterea în greutate dar nu afectează fertilitatea (8).

Prevalența crescândă a obezității umane și a tulburărilor metabolice (9) a concentrat cercetările asupra rolului fiziologic al leptinei în echilibrul energetic și aportul alimentar la mamiferele adulte. Recent, legăturile dintre greutatea la naștere și tulburările metabolice la debutul adulților (10) au îndreptat atenția asupra posibilelor relații dintre leptină, creștere și dezvoltare în timpul etapelor fetale. Leptina circulantă este crescută la fătul uman în timpul gestației târzii și se corelează cu masa grasă și greutatea la naștere (11, 12). La șoarece fetal, leptina și LR sunt exprimate în ficat, inimă, foliculi de păr și os primordial înainte de formarea țesutului adipos (13, 14), iar leptina se găsește în circulația ovinelor fetale (15). Deși aceste modele de exprimare sugerează un rol pentru leptină la făt, se știe puțin despre funcțiile leptinei în dezvoltarea timpurie.

În acest articol, raportăm despre clonarea moleculară a omologilor de broască a genelor receptorilor ob și ob de mamifere (obr) și caracterizarea funcțională a produselor proteice ale acestor gene la un vertebrat nonamniot. Broasca leptină și LR (corespunzătoare LRb la mamifere) sunt exprimate de-a lungul embriogenezei și dezvoltării mormolocului și sunt exprimate pe scară largă la broasca juvenilă. Injecția intracerebroventriculară de leptină de broască recombinantă (rxLeptin) a exercitat efecte anorexigenice puternice la mormolul midprometamorfic și la broasca juvenilă, dar nu și la mormolul prometamorfic timpuriu. LR este exprimat în membrul posterior al mormolilor prometamorfici timpurii, iar tratamentul cu rxLeptin a indus creșterea membrelor posterioare și formarea cifrelor in vivo și a stimulat absorbția [3H] timidinei in vitro. Astfel, pe lângă rolul său integral de regulator al apetitului și al echilibrului energetic, leptina poate îndeplini și funcții noi ale factorilor de creștere în timpul dezvoltării timpurii.

Rezultate

Clonarea moleculară a genelor Frog ob și obr.

Am izolat și secvențiat regiunea de codificare a unei gene Xenopus laevis ob, împreună cu 5 'UTR complet și ≈600 pb din 3' UTR. Produsul proteic prezis de 16,9 kDa al genei broască ob are o peptidă semnal 21-aa și o peptidă matură 148-aa. Gena leptinei broaște are trei exoni și doi introni, cu secvența codificatoare în exonii 2 și 3, similară cu structura genomică a genelor ob mamifere (Fig. 1 A). Broasca leptină este 35% similară cu cea umană, 34% asemănătoare cu puiul, dar numai 13% similară cu o leptină supusă pufferfish (ref. 16; Fig. 1 B). Structurile terțiare prevăzute ale leptinelor de broască, șobolan și pește puffer derivate din algoritmul SWISS - MODEL (17) sunt foarte conservate în ciuda divergenței considerabile în structurile primare dintre specii (Fig. 1 C).

Caracterizarea moleculară a leptinei de broască. (A) Structura genomică prezisă a genei ob broască este păstrată la om. Umbrirea întunecată arată regiunile de codificare. (B) Alinierea aminoacizilor a leptinelor vertebratelor. Vârfurile de săgeată prezintă cisteine ​​conservate. Nr. De acces GenBank. sunt după cum urmează: X. laevis, AY884210; uman, NP000221; război, BAA08296; pui, AF012727; pufferfish (Tetraodon), AB193549. (C) Diagramele pe panglică ale structurilor terțiare prezise ale leptinelor X. laevis, șobolan și pufferfish (SWISS - MODEL server automatizat de modelare a omologiei proteinelor; bazat pe fișierul structurii 1AX8.pdb a leptinei umane Protein Data Bank).

De asemenea, am izolat un ADNc de lungime completă corespunzător unei gene supuse obr din plămânul Xenopus tropicalis. Gena prognozată a broaștei (Fig. 2 A) se întinde pe 87,3 kb de ADN genomic și constă din 26 de exoni, 8 exoni de 5 ′ UTR (826 bp) și 18 exoni de secvență codificatoare (3.436 bp; 1.145 aa) și parțial 3 ′ UTR (129 pb). Proteina LR de broască prezisă este 37,5% identică cu LR umană; similitudinea secvenței este cea mai mare în și în jurul domeniului de legare a ligandului, regiunea transmembranară și regiunea C-terminală intracelulară (vezi informațiile de susținere, care sunt publicate pe site-ul web PNAS). Această secvență include exonul terminal 922-bp care corespunde exonului terminal extins al mamiferelor, care codifică domeniul intracelular C-terminal al formei lungi LR. La mamifere, două reziduuri de tirozină (Tyr-985 și Tyr-1138 la șoarece) din acest exon sunt esențiale pentru semnalizarea intracelulară (7), iar aceste reziduuri sunt conservate în broasca obr (a se vedea informațiile de susținere). Algoritmul ProDom (18) a confirmat că această secvență de ADNc este un omolog de broască al genelor obr de mamifere (la P signalp 3.0 (20) a prezis o peptidă de semnal în primii 21 bp ai secvenței de codare, care este egală ca dimensiune cu peptida de semnal a LR uman.

Exprimarea mRNA-urilor de leptină și LR la broască. (A) Distribuția țesuturilor la broaște juvenile de mRNA de leptină și LR a fost analizată prin RT-PCR cantitativă (vezi Metode). Nivelurile de ARNm de Leptină și LR au fost normalizate la expresia genei proteinei ribozomale L8 (rpL8). (B) Expresia de dezvoltare a mARN-ului leptinei în X. laevis a fost analizată prin RT-PCR semicantitativă (vezi Metode).

Analize de admisie alimentară.

Efectele i.c.v. injectarea rxLeptinei la timpul petrecut în căutarea la mormoloci S. hammondii prometamorfici sau midprometamorfici timpurii și la mărimea mesei la puietul X. laevis. Scrisorile indică diferențele perechi ale Duncan între tratamente [P 3 H] Absorbția timidinei in vitro.

Deși injecțiile cu rxLeptin nu au afectat hrănirea sau creșterea corpului la mormolile prometamorfice timpurii, am constatat o creștere semnificativă a creșterii membrelor posterioare și diferențierea cifrelor în ambele hrănite [membrul posterior ANOVA: F = 3,95, P = 0,035; analiza stadiului de covarianță (ANCOVA): F = 3,64, P = 0,030] și lipsită de alimente (membrul posterior ANOVA: F 3,36 = 8,9, P = 0,0002; stadiul ANCOVA: F = 8,95, P = 0,001) animale (Fig. 5 A - C); lungimea cozii și a corpului nu a fost afectată de tratamentul cu rxLeptin (datele nu sunt prezentate). În acest stadiu de dezvoltare, membrul posterior este singurul țesut în care cartilajul și osul sunt formate de novo. Am găsit ARNm de LR, dar nu de leptină, la nivelul membrului posterior al mormolilor prometamorfici X. laevis timpurii (stadiul NF 54-56; Fig. 5 D). rxLeptina a stimulat absorbția [3H] timidinei de către membrele posterioare cultivate de la mormolile X. laevis prometamorfice timpurii (stadiul NF 54-56) într-o manieră dependentă de doză (control, 0,74 ± 0,24; 1 ng/ml rxLeptină, 2,36 ± 0,75; 10 ng/ml rxLeptină, 3,56 ± 0,91; ANOVA, F = 6,557, P = 0,013; raporturi log 10 transformate). Luate împreună, rezultatele noastre arată că leptina, acționând probabil prin LR, poate promova creșterea și diferențierea membrelor în timpul dezvoltării postembrionare timpurii.

Efectele injecțiilor cu rxLeptină asupra creșterii și dezvoltării membrelor posterioare la mormolile S. hammondii prometamorfe timpurii. (A) Lungimea medie ± SEM a membrului posterior împărțită la lungimea corpului și stadiul Gosner înainte și după injecțiile cu rxLeptină (i.p. în fiecare zi timp de 7 zile; n = 8 per tratament). Scrisorile indică diferențele perechi ale lui Duncan între tratamentele [P 3 H] captarea timidinei de către membrele posterioare cultivate de mormoloc susține opinia că leptina joacă un rol ca factor de creștere în timpul dezvoltării vertebratelor. sugerând că leptina de origine hemocrină mediază dezvoltarea membrelor mormolocului.

Există dovezi că leptina joacă un rol în dezvoltarea membrelor mamiferelor. ARNm-urile Leptinei și LR sunt exprimate în os și cartilaj ale femurului și ale membrelor posterioare ale șoarecilor fetali de 13,5 zile postcoitus (13, 32). De asemenea, injecțiile cu leptină au îmbunătățit masa și densitatea osoasă a membrelor la șoarecii ob/ob cu deficit de leptină juvenilă (33), deși alții au descoperit că leptina a avut efecte negative asupra creșterii osoase mediate de hipotalamus (34). Gat-Yablonski și colegii (35) au arătat că tratamentul cu leptină a restabilit scăderea masei osoase a membrelor indusă de foamete la șoareci tineri, ceea ce este în concordanță cu constatarea noastră că injecțiile cu leptină au restabilit creșterea și dezvoltarea membrelor posterioare la mormolocurile lipsite de alimente. Luate împreună, aceste descoperiri evidențiază potențialul funcțiilor independente de adipocite ale leptinei în dezvoltarea timpurie.

Metode

Clonarea moleculară a broaștei Omologi ai genelor mamifere ob și obr.

Am identificat mai întâi o prezumtivă secvență de leptină de broască în baza de date a genomului X. tropicalis (JGI v. 3.0; Joint Genome Institute) prin căutarea secvențelor de aminoacizi cu similitudine cu leptina umană, proiectarea oligonucleotidelor pe baza acestor regiuni de similaritate și amplificarea fragmentelor de ADNc din X. laevis creier, ficat și grăsime folosind PCR. Am folosit o amplificare aleatorie a capetelor ADNc (kit SMART RACE; CLONTECH) pentru a izola capetele 5 'și 3' ale moleculei și ulterior am proiectat primeri pentru a amplifica un ADNc parțial. Am determinat structura genomică a genei broaștei ob prin alinierea ADNc-ului X. laevis amplificat cu secvențele genomice X. tropicalis.

Am identificat o genă presupusă de broască obr în baza de date a genomului X. tropicalis (JGI v. 4.1) prin căutarea prin explozie cu secvențe specifice de aminoacizi de exoni de mamifere. Aceste căutări au dat secvențe multiple într-un interval de 100.000-bp de ADN genomic pe eșafodul 4; am folosit genescan (versiunea 1.0; ref. 36) pentru a prezice limitele exon/intron. Pentru a localiza 5 'UTR, am efectuat căutări explozive ale genomului tropical X. folosind secvențele obr exon 1 și 2 umane. Am proiectat apoi primeri pentru a amplifica întreaga secvență de codificare LR din ARN pulmonar X. tropicalis.

Am subclonat întreaga regiune de codificare a leptinei broaștei în pET 151/D-TOPO și întreaga regiune de codare a broastei LR în pcDNA3.1/D-TOPO urmând instrucțiunile producătorului (Invitrogen). Acești vectori au fost utilizați ulterior pentru exprimarea proteinelor în Escherichia coli și, respectiv, transfecție tranzitorie în celule de mamifere.

Analiza RTqPCR a mRNA-urilor Leptin Frog și LR.

Am folosit RTqPCR pentru a determina distribuția tisulară a mRNA-urilor de leptină și LR și pentru a compara nivelurile relative de expresie la broaștele juvenile. Am izolat ARN-urile din țesuturile broaștei folosind reactivul TRIzol (Invitrogen) și am sintetizat ADNc folosind Superscript II (Invitrogen) urmând instrucțiunile producătorului. Am dezvoltat teste TaqMan și am analizat eșantioane pe o mașină de PCR rapidă ABI 7500 în timp real folosind TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Seturile de grund/sondă au fost proiectate pentru a acoperi limitele exon/intron și sunt descrise în informații de susținere. Curbele standard au fost generate utilizând ADNc din țesuturi care au prezentat cel mai înalt nivel de expresie pentru fiecare genă. Leptina și ARNm LR au fost normalizate la nivelul ARNm L8.

Pentru RT-PCR semicantitativă, am folosit polimeraza HotStar Taq (Qiagen, Valencia, CA) urmând protocolul producătorului. Primerii oligonucleotidici și condițiile PCR utilizate sunt descrise în informațiile justificative.

Producția de Leptină de broască recombinantă.

Am produs leptină X. laevis recombinantă în E. coli folosind vectorul de expresie pET 151/D-TOPO (Invitrogen) transformat în celule BL21 Star (DE3) (Invitrogen). Am purificat rxLeptina din corpurile de incluziune prin fracționarea lizatului bacterian pe un gel SDS/PAGE de 12%, electroeluând în 20 mM bază Tris/150 mM glicină/0,01% SDS (pH 7,0) și dializând peste noapte împotriva 10 mM bicarbonat de amoniu.

Transfecția celulară.

Am stabilit mai întâi dacă rxLeptin ar putea activa LRb de șoarece în testele de transfecție. Apoi am folosit testul de transfecție pentru a testa dacă broasca LR pe care am izolat-o este funcțională. Am cotransfectat celule COS-7 (40.000 de celule pe godeu; plăci de cultură cu 24 de godeuri) fie cu vectorul de expresie al receptorului LR de șoarece sau broască pcDNA3.1 (200 ng) și cu un constructor de raportare a luciferazei receptive STAT-3 (GAS; 100 ng; ref. 37) folosind reactivul de transfecție FuGENE 6 (Roche Biosciences). De asemenea, am transfectat celule cu constructor reporter de luciferază Renilla (2 ng; Promega) pentru normalizarea eficienței transfecției. După transfecție, celulele au fost lipsite de ser timp de 14-15 ore înainte de adăugarea diferitelor concentrații de recombinant uman sau rxLeptin. După 6 ore, am recoltat celule și am măsurat atât licurici, cât și activități de luciferază Renilla folosind un test reporter dual-luciferază (Promega).

Analize de admisie alimentară.

[3 H] Testul absorbției timidinei.

Membrele posterioare au fost recoltate de la mormoloci X. laevis (etapa NF 54-56) și cultivate individual într-o placă cu 24 de godeuri. Un membru a servit drept martor (mediu de cultură singur, n = 5), în timp ce celălalt a servit ca tratament experimental (mediu de cultură plus 1 sau 10 ng/ml rxLeptină; n = 5 și respectiv n = 4). Am cultivat membre în mediu L-15 (conținând penicilină, streptomicină și FBS dezbrăcat de hormoni tiroidieni; diluat 1: 1,5) sub o atmosferă umidificată de 5% CO2 și 95% O 2 la 25 ° C cu agitare ușoară timp de 48 de ore. Am adăugat apoi [3 H] timidină (0,75 μCi pe godeu; PerkinElmer) în fiecare godeu și am incubat încă 16 ore înainte de spălarea țesuturilor cu PBS rece ca gheața, fixând în acid tricloracetic 5% timp de 20 de minute la 4 ° C și lizând în NaOH 1 M. După 30 de minute de agitare ușoară la 65 ° C, am măsurat radioactivitatea din extractele celulare prin numărarea scintilației lichide.

Mulțumiri

Mulțumim Georginei Mang, Hynsuk Roh, Graham Boorse, Keith Williamson, Aaron Hoffman și Miranda Hicks-Courant pentru asistență tehnică și discuții. Vectorii de expresie LR de reporter GAS-luciferază și șoarece au fost furnizați cu generozitate de Dr. Martin Myers și Dr. Craig Jaffe a furnizat leptină umană recombinantă. Această lucrare a fost susținută de Grantul IBN 0235401 al Fundației Naționale a Științei (către R.J.D.). Această lucrare a folosit nucleul molecular al Centrului de Cercetare în Cercetarea Diabetului din Michigan, finanțat de Institutul Național de Sănătate Grant NIH5P60 DK20572.

Notă adăugată în dovadă.

Boswell și colab. (39) a raportat recent izolarea unei gene asemănătoare leptinei în salamandra de tigru care are 60% similaritate de secvență cu X. laevis leptin.

Note de subsol

    † Cui trebuie să i se adreseze corespondența. E-mail: rdenverumich.edu

↵ * Adresa actuală: Departamentul de Biologie, Colegiul Vassar, 124 Raymond Avenue, Poughkeepsie, NY 12604.

Contribuțiile autorului: E.J.C. și R.J.D. a proiectat cercetări, a efectuat cercetări, a analizat date și a scris lucrarea.

Declarație privind conflictul de interese: nu s-au declarat conflicte.

Această lucrare a fost trimisă direct (pista II) la biroul PNAS.

Depunerea datelor: Secvențele raportate în această lucrare au fost depuse în baza de date GenBank [nr. AY884210 (ARNm obez X. laevis), DQ149644 (ADNc parțial al receptorului leptinei X. laevis) și DQ401069 (ARNm receptorului leptinei X. tropicalis)].