• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

Abstract

Introducere

Melanomul metastatic este o malignitate agresivă și de obicei fatală. Melanoamele avansate au mai mulți factori oncogeni și, în ciuda progreselor cu BRAF și inhibitori ai punctului de control imun, rezistența la terapie este o problemă semnificativă (1). Având în vedere eficacitatea incompletă și durabilitatea opțiunilor actuale de tratament și înclinația enormă a melanoamelor pentru rezistență, există o nevoie urgentă de a identifica noi ținte moleculare pentru melanom. În această lucrare, testăm ipoteza că proteina majoră de șoc termic inductibilă la stres 70 (numită și HSP72 sau HSPA1A, dar denumită în continuare HSP70) ar putea oferi o cale terapeutică nouă, atât singură, cât și în combinație cu terapiile actuale.

inhibarea

În această lucrare, am efectuat primul microarray tumoral de melanom pentru HSP70, folosind un anticorp specific pentru forma majoră indusă de stres care nu reacționează încrucișat cu alte izoforme (11). Arătăm că HSP70 este extrem de exprimat într-un procent mare de melanoame și că expresia acestei proteine ​​crește odată cu stadiul avansat. Folosim tehnica matricei de proteine ​​în fază inversă (RPPA) în melanoame pentru a identifica proteinele client HSP70 și a identifica pFAK și BRAF ca două proteine ​​client relevante și specifice melanomului HSP70. Arătăm că inhibarea pFAK utilizând inhibitorul HSP70 PET-16 duce la scăderea capacității melanoamelor de a migra, invada și metastaza in vivo. În plus, arătăm că forma mutantă V600E a BRAF, prezentă în până la 50% din tumorile melanomului, este un client al HSP70. În această direcție, arătăm că PET-16 se sinergizează cu inhibitori BRAF, păstrează citotoxicitatea în melanoamele rezistente la inhibitorii BRAF și extinde durabilitatea tratamentului cu inhibitori BRAF. Aceste date combinate augur pentru utilizarea eventuală a inhibitorilor HSP70 pentru terapia cu melanom.

Materiale și metode

Linii celulare, tratamente și reactivi

Toate liniile celulare de melanom uman au fost obținute din colecția Wistar Institute și au fost confirmate prin genotipare. Aceste celule au fost menținute în mediu L-15 (Cellgro) MCDB153 (Sigma)/Leibovitz (raport 4: 1) suplimentat cu 2% FCS și 2 mmol/L CaCl2. Celulele H1299, B16-F10 și fibroblastele au fost obținute de la ATCC în decurs de 6 luni de la utilizarea lor și au fost menținute în DMEM (Invitrogen). Linia celulară FS5, oferită cu amabilitate de Ashani Weeraratna (Institutul Wistar, Philadelphia, PA), a fost menținută în RPMI 1640, iar linia celulară Yumm1.7 (oferită cu amabilitate de Marcus Bosenburg, Universitatea Yale, New Haven, CT) a fost menținută în DMEM/F12 (Invitrogen). Toate mediile de mai sus au fost suplimentate cu 10% FBS (Invitrogen) și 100 U/ml penicilină și streptomicină. Stocurile de celule au fost amprentate folosind AmpFLSTR Identifier PCR Amplification Kit de la Life Technologies la Wistar Institute Genomics Facility. PET-16 (bromură de trifenil (feniletinil) fosfoniu; Sigma; catalog # S16773) și vemurafenib/PLX4032 (S1267; Selleckchem) au fost preparate sub formă de soluții stoc de 50 mmol/L în DMSO și depozitate la -80 ° C.

Western blot, imunoprecipitare și shRNA

Western blot a fost efectuat așa cum este descris (7). Anticorpii primari utilizați în acest studiu includ HSP70 (4873S; Cell Signaling Technology), anti-HA (3724; Cell Signaling Technology), FAK total (EMD Millipore; 05-537), FAK Tyr-397-P (44-625G; Invitrogen ), BRAF (sc-5284; Santa Cruz Biotechnology) și GAPDH (14C10; Cell Signaling Technology; 2118). Anticorpii secundari conjugați cu peroxidaza de hrean au fost folosiți la o diluție de 1: 10.000 (imunochimice Jackson). ECL (Amersham; RPN2232) a fost aplicat pe pete, iar nivelurile de proteine ​​au fost detectate folosind autoradiografia. Cuantificarea densitometriei semnalelor proteice a fost efectuată utilizând software-ul ImageJ (NIH). Pentru westernurile IP, 1.000 μg de lizat au fost imunoprecipitate așa cum este descris (12) cu 0,5 μg de antiseruri la HSP70, urmate de SDS-PAGE, transfer și analiză occidentală folosind antiseruri la FAK total, FAK Tyr-397-P și BRAF Linia celulară 1205Lu cu eliminarea shRNA a PTK2/FAK a fost generată de infecția cu vectorul lentiviral pLKO.1-puro purtând oricare dintre cele două secvențe shRNA împotriva PTK2 uman: shRNA (CCGGTCGAATGATAAGGTGTA; TRCN0000001620 și CAACAGGTGAAGAGCGATTAT; TR). Celulele stabile au fost selectate folosind puromicină (1 μg/ml), iar eliminarea PTK2/FAK a fost confirmată prin Western blot.

Testele de viabilitate celulară și testarea sinergiei medicamentelor

Celulele melanomului uman au fost placate la 2.000 de celule pe godeu în plăci cu 96 de godeuri. După 24 de ore, celulele au fost tratate cu diluții seriale de medicamente individuale sau combinații de două medicamente la un raport molar constant. După 72 de ore, viabilitatea celulei a fost măsurată cu albastru Alamar (Life Technologies; DAL1025) utilizând un cititor de plăci SynergyHT (BioTek). Valorile indicelui de combinație (CI), stabilite prin metoda Chou-Talalay (13), au fost calculate utilizând pachetul software CompuSyn (CompuSyn). Celulele rezistente la inhibitori BRAF au fost generate de creșterea celulelor parentale în prezența 1 μmol/L, 5 μmol/L sau 10 μmol/L PLX4720 pentru cel puțin patru pasaje. Rezistența a fost confirmată prin analiza IC50.

Imunofluorescență, imunohistochimie și microarray de țesut tumoral

Pielea tridimensională organotipică se reconstituie

Reconstrucțiile pielii umane au fost generate așa cum s-a descris anterior (17). Pe scurt, reconstituirile cutanate au constat din colagen de coadă de șobolan tip I contractat timp de 4 zile cu fibroblaste dermice încorporate (7,5 × 10 4 per vas) înainte de însămânțarea a celulelor 1205L (0,83 × 105) împreună cu keratinocite (4,17 × 105) deasupra reconstrucția cutanată pe o perioadă de 4 zile în mediu înainte de expunerea la aer până în ziua 18 pentru a permite diferențierea epidermică. În ultimele 7 zile, reconstituirea pielii a fost tratată cu DMSO sau PET-16 care au fost adăugate la mediu. În ziua 18, reconstituirile pielii au fost recoltate și fixate în formalină tamponată neutră 10% timp de 2 până la 3 ore, încorporate în parafină, secționate (5 μm) și apoi colorate cu hematoxilină și eozină.

Probele triplicate de celule WM793 și 1205Lu au fost tratate cu vehicul, 1 μmol/L, 3 μmol/L, 5 μmol/L și 10 μmol/L PET-16 timp de 24 de ore. În urma protocoalelor standard ale RPPA Core Facility de la MD Anderson Cancer Center (Houston, TX), celulele au fost lizate pe gheață, iar lizatele au fost curățate prin centrifugare și denaturate în tampon de probă SDS și apoi supuse analizei așa cum este descris (18, 19) . Comparațiile pe grupe perechi s-au făcut folosind testul cu două eșantioane, iar metoda Benjamini-Hochberg a fost utilizată pentru corecție pentru testarea multiplă. Proteinele care pentru o concentrație de PET-16 au trecut pragul FDR 1.2 în cel puțin o linie celulară au fost considerate semnificativ exprimate diferențial. Datele au fost vizualizate ca hărți de căldură de expresie folosind Microsoft Excel.

Vindecarea rănilor, invazia și testul migrației Transwell

Modele experimentale de metastaze pulmonare, alogrefe și xenogrefe

Analiza statistică a datelor

Inhibitorii HSP70 blochează migrația, invazia și capacitatea metastatică a melanomului

Având în vedere rolul FAK (în special forma p-Y397 activată autofosforilată) în fenotipurile invazive tumorale, am urmărit în continuare să evaluăm impactul PET-16 asupra migrației și invaziei. Am efectuat mai întâi teste convenționale de „rănire-zgârietură” în care capacitatea celulelor tumorale de a migra și de a umple o zonă este evaluată prin microscopie time-lapse. Pentru aceste studii, am fost atenți să folosim concentrații, iar punctele de timp ale tratamentului cu PET-16 nu au fost citotoxice și acest lucru nu a inhibat proliferarea celulară (Fig. S4B și S4C suplimentare). Aceste teste ale rănilor prin zgârieturi au arătat că, după tratamentul cu PET-16, capacitatea celulelor 1205Lu de a migra și de a completa o rană a fost afectată semnificativ (Fig. 3A). După 48 de ore, proba de control DMSO a fost completată complet, în timp ce proba PET-16 a fost finalizată mai puțin de 50% (Fig. 3B). Microscopia cu intervale de timp a confirmat faptul că celulele tratate cu PET-16 au continuat să prolifereze, în timp ce au încetat să migreze (vezi filmul suplimentar). Pentru a extinde această constatare, am efectuat teste de migrare Transwell. Din nou, la doze care nu sunt citotoxice sau citostatice, am observat migrarea semnificativ afectată a celulelor 1205Lu după tratamentul cu PET-16 (Fig. 3C).

FAK este necesară pentru capacitatea PET-16 de a inhiba invazivitatea melanomului. A, analiza Western blot a nivelului FAK total în celulele 1205Lu combinate infectate cu un vector de control lentiviral (shControl) sau un ac scurt de păr îndreptat către FAK (shFAK). Nivelul GAPDH a servit drept control de încărcare. B, analiza invaziei în cameră Boyden a 1205L celule descrise în A tratate cu DMSO sau 0,5 μmol/L de PET-16 timp de 24 de ore. Un număr egal de celule au fost însămânțate în camera Boyden și incubate timp de 24 de ore. După 24 de ore, celulele invadate prin Matrigel au fost colorate. Bara de scalare, 100 μm. C, numărul de celule invadate din B a fost cuantificat în cinci câmpuri diferite pentru fiecare grup experimental și calculat în medie. Datele sunt rezultatele medii ale trei experimente independente. Barele de erori, SE. Diferența de inhibare procentuală a invaziei de către PET-16 în liniile celulare vectoriale și shFAK este foarte semnificativă (P = 0,005).

Inhibarea metastazelor de către inhibitorii HSP70 PES-Cl și PET-16. A, reprezentare schematică a testului metastazei. Celulele B16-F10 au fost pretratate cu DMSO sau 3 μmol/L PES-Cl sau PET-16 timp de 24 de ore. După 24 de ore, celulele au fost monitorizate pentru viabilitate prin test viu/mort și 2,5 × 104 celule viabile au fost injectate în vena cozii șoarecilor C57Bl/6. În ziua 7, tratamentul săptămânal a fost inițiat cu PES-Cl și PET-16 la dozele indicate. După 3 săptămâni, plămânii șoarecilor au fost evaluați pentru prezența nodulilor metastatici. B, imagini reprezentative ale metastazelor pulmonare (sus) și hematoxilină și eozină colorate (jos) de la șoareci C57Bl/6 după tratamentul cu vehicul, PES-Cl sau PET-16. Bara de scalare, 100 μm. C, reprezentare grafică a datelor din B, unde plămânii au fost punctați în mod orb pentru metastaze (n = 10 șoareci/grup). D, analiza imunofluorescenței pentru fosfo-FAK (pTyr-397) în plămâni de la șoareci descrisă în A. Scala bar, 15 μm.

Inhibitorul HSP70 PET-16 se sinergizează cu inhibitorii BRAF in vitro și sporește eficacitatea inhibiției BRAF in vivo