Marcelo P. Gomes

1 Laboratorul de ecotoxicologie a microorganismelor acvatice, GRIL, TOXEN, Departamentul de Științe Biologice, Universitatea Quebec din Montreal, Montreal, QC, Canada

2 Laborator de fiziologie vegetală, Institutul de Științe Biologice, Departamentul de Botanică, Universitatea Federală din Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazilia

Sarah G. Le Manac’h

1 Laboratorul de ecotoxicologie a microorganismelor acvatice, GRIL, TOXEN, Departamentul de Științe Biologice, Universitatea Quebec din Montreal, Montreal, QC, Canada

Louise Hénault-Ethier

3 Institutul de Științe ale Mediului, Universitatea Quebec din Montreal, Montreal, QC, Canada

Michel Labrecque

4 Institutul de Cercetare Vegetariană, Grădina Botanică din Montreal, Montreal, QC, Canada

Marc Lucotte

3 Institutul de Științe ale Mediului, Universitatea Quebec din Montreal, Montreal, QC, Canada

Philippe Juneau

1 Laboratorul de ecotoxicologie a microorganismelor acvatice, GRIL, TOXEN, Departamentul de Științe Biologice, Universitatea Quebec din Montreal, Montreal, QC, Canada

3 Institutul de Științe ale Mediului, Universitatea Quebec din Montreal, Montreal, QC, Canada

Date asociate

Abstract

Introducere

Glifosatul (N- (fosfonometil) glicina) este cel mai utilizat erbicid la nivel mondial de la introducerea plantelor rezistente la glifosat (GR) (Coupe și colab., 2012). Deși a fost sugerat ca unul dintre cele mai puțin toxice pesticide pentru animale și oameni (Williams și colab., 2000; Cerdeira și Duke, 2006), utilizarea pe scară largă a glifosatului împreună cu solubilitatea sa mare declanșează unele îngrijorări cu privire la posibilele sale efecte asupra mediu inconjurator.

Speciile reactive de oxigen sunt esențiale în semnalizarea plantelor; cu toate acestea, odată acumulate, ROS devine toxic, inducând modificări ireversibile în metabolism, ciclul celular și cresc explozii oxidative (Gomes și colab., 2014a). Prin interacțiunea cu moleculele biologice, ROS poate induce distrugerea ADN-ului, lipidelor și proteinelor (Foyer și Noctor, 2011). Pentru a evita deteriorarea oxidativă datorată acumulării ROS, plantele au dezvoltat sisteme enzimatice (de exemplu, SOD, CAT, APX, GPX și GR) și non-enzimatice (de exemplu, ascorbat și glutation) (Foyer și Noctor, 2011). Activitatea sistemelor antioxidante, precum și extinderea peroxidării lipidelor sunt markeri de stres oxidativ care s-au dovedit a fi modulați prin expunerea la glifosat (Ahsan și colab., 2008; Moldes și colab., 2008; Miteva și colab., 2010).

Materiale și metode

Experimente cu efect de seră

Evaluările fotosintetice (folosind măsurători cinetice ale fluorescenței clorofilei) și biochimice au fost efectuate la 0, 6, 24, 48 și 72 ore după începerea tratamentelor. Evaluările au fost oprite după 72 de ore de expunere, deoarece plantele din cel mai înalt tratament cu glifosat au prezentat simptome pronunțate de intoxicație, inclusiv mai multe pete necrotice și pierderea frunzelor (datele nu sunt prezentate). După evaluările de conductanță fotosintetică și stomatală, plantele au fost recoltate și spălate bine cu apă distilată. Probele de a șaptea (prima frunză complet extinsă de la vârf) la a noua frunze au fost imediat înghețate în azot lichid și depozitate în hârtie de folie de aluminiu la -80 ° C până la evaluări biochimice și evaluări ale daunelor oxidative.

Schimb de gaze, fluorescența clorofilei și concentrațiile pigmentare

Schimbul de gaze, fluorescența clorofilei și conținutul de pigment au fost măsurate pe probe din prima, a doua și a treia frunză complet expandată (a șaptea - a noua frunză din vârf), care au primit și erbicidul, pentru un total de trei măsurători pe plantă. Măsurătorile conductanței stomatale (gs) au fost efectuate folosind un porometru de frunze (model SC-1, Decadon Devices Inc., Washington, DC, SUA). Apoi, aceste frunze au fost aclimatizate la întuneric timp de 20 de minute și emisia de fluorescență a clorofilei a fost evaluată utilizând un fluorometru de modulare a amplitudinii pulsului (PAM) (model PAM-2500, WALZ, Effeltrich, Germania). O analiză RLC a fost efectuată conform lui Juneau și colab. (2015). A fost efectuat un RLC în 11 etape. Impulsurile de saturație au fost declanșate la intervale de 0,8 minute cu intensitate a luminii actinice variabile pentru fiecare pas (0, 31, 48, 76, 117, 179, 253, 405, 586, 874 și 1326 μmol fotoni m -2 s -1). Folosind RLC, s-a efectuat evaluarea următorilor parametri: ETR (Krall și Edwards, 1992), qP (van Kooten și Snel, 1990), UQFrel (Juneau și colab., 2005), NPQ (Redondo- Gómez și colab., 2008) și FV/FM (Chinaima și Butler, 1975). Pentru a compara tratamentele, s-au folosit rezultatele fluorescenței din fotonii 874 μmol m -2 s -1 (cea mai similară iradiere în raport cu condițiile de creștere a luminii). Curbele ETR versus iradiere au fost, de asemenea, reprezentate, iar ETRmax și Ik au fost calculate conform Eilers și Peeters (1988).

Pentru evaluarea pigmenților, s-au luat trei discuri foliare de aproximativ 5 mm în diametru din fiecare frunză, iar după determinarea greutății proaspete a probelor, pigmentii lor clorofilici și carotenoizi au fost extrase în acetonă 80% după macerarea discurilor cu un mortar și un pistil. Absorbția spectrală a extractelor (de la 300 la 800 nm) a fost măsurată folosind un spectrofotometru Varian Cary® 300 Bio UV-Vis (Varian, SUA). Concentrațiile (μg/g greutate proaspătă a frunzelor) ale clorofilelor și carotenoidelor totale au fost calculate utilizând ecuațiile descrise de Lichtenthaler și Wellburn (1983).

Evaluări biochimice

Pentru a evalua răspunsurile oxidative, conținutul de H2O2, MDA și activitatea sistemelor antioxidante au fost studiate urmând metodele descrise de Gomes și colab. (2014c). H2O2 a fost extras în 2 ml acid tricloracetic 0,1% (TCA) și după centrifugare la 12000 × g timp de 15 minute, 300 pl din supernatantul centrifugat au reacționat cu 0,5 ml tampon fosfat de potasiu 10 mM (pH 7,0) și 1 ml de 1 M KI. Probele au fost citite la 390 nm și concentrațiile de H2O2 au fost determinate folosind un coeficient de extincție (() de 0,28 mM -1 cm -1. Estimarea peroxidării lipidelor sa bazat pe producția de metaboliți reactivi ai acidului 2-tiobarbituric, în special MDA. Probele care conțin 200 mg de frunze și țesut rădăcină au fost macerate în 5 ml de 0,1% TCA. După omogenizarea completă, 1,4 ml de omogenat au fost transferați într-un tub de eppendorf și centrifugați la 10.000 rpm timp de 5 minute. O alicotă de 0,5 mL de supernatant a fost adăugată la 2 mL de 0,5% (v/v) TBA (acid tiobarbituric) în 20% TCA. Amestecul a fost încălzit într-o baie de apă la 95 ° C timp de 30 min și apoi răcit cu gheață timp de 10 min. Citirile au fost efectuate folosind un spectrofotometru la 535 și 600 nm.

Pentru a studia enzimele antioxidante, 0,1 g de frunze au fost macerate în 800 μl dintr-un tampon de extracție conținând 100 mM tampon de potasiu (pH 7,8), 100 mM EDTA, 1 mM L-acid ascorbic și 2% PVP (m/v). Conținutul de proteine ​​al probelor a fost determinat folosind metoda Bradford. Au fost evaluate activitățile SOD (EC 1.15.1.1), CAT (EC1.11.1.6), APX (EC 1.11.1.11), GPX (EC 1.11.1.9) și GR (EC 1.6.4.2). Pentru a evalua grupul de ascorbat [ascorbat total (AsA + DHA), AsA și DHA], 0,2 g de țesut înghețat au fost măcinate în azot lichid într-un mortar și pistil și omogenizate cu 5 ml de 6,5% (g/v) m-fosforic acid care conține NaEDTA 1 mM.

Analize statistice

Rezultatele au fost exprimate ca media a trei replici. Analizele statistice au fost efectuate utilizând software-ul JMP 10.0 (SAS Institute Inc). Rezultatele au fost supuse testelor de normalitate (Shapiro-Wilk) și omogenitate (Bartlett) și apoi evaluate statistic. Măsurile repetate univariate MANOVA, având ca factor principal subiectul timpului și efectele principale ale concentrațiilor de erbicide, au fost utilizate pentru a analiza diferențele în variabilele studiate în timpul expunerii la tratamente. Glifosatul, timpul și interacțiunea dintre glifosat și timp au fost incluse în model. Sfericitatea datelor a fost testată de criteriile lui Mauchly pentru a determina dacă testele F univariate pentru efectele din cadrul subiectului au fost valide. În cazurile de F invalid, testul Greenhouse - Geisser a fost utilizat pentru a estima epsilon ((). Analiza contrastului a fost utilizată atunci când au existat diferențe semnificative în variabilele dintre tratamente (Tabelele suplimentare 1S și 2S).

Rezultate

Conținutul pigmentar, schimbul de gaze și fluorescența clorofilei

Concentrațiile totale de clorofilă și plastochinone au fost scăzute în frunzele plantelor prin expunerea la erbicide și după timpul de tratament (P> 0,001; Figura Figura 1 1 ). Concentrația de carotenoizi a fost mai mare la plantele tratate cu erbicide la 6 ore pentru toate dozele aplicate (Figura Figura 1 1 ); apoi, concentrația de carotenoizi a scăzut la plantele expuse cel puțin 24 de ore la concentrații de erbicide (P Figura 1.1 ). Efecte similare au fost observate asupra ETRmax, Ik și qP, care au fost semnificativ reduse la plantele tratate (P Figura 2 2 ). Cu toate acestea, pentru prima evaluare (6 ore), ETRmax, Ik și qP nu au fost scăzute la plantele tratate cu 1,4 kg e.e ha -1 (P> 0,05; Figura Figura 2 2 ). UQFrel a crescut la toate plantele tratate (Figura Figura 1 1 ). Concomitent, NPQ a scăzut la plantele expuse mai mult de 24 de ore la erbicid (P Figura 2 2 ). Eficiența fotochimică maximă PSII (FV/FM) a fost scăzută la plantele tratate cu erbicide (P -1 numai după 72 de ore de expunere la erbicid (P Figura 2 2 ). Plantele expuse la 2,1 kg e.e ha -1 au prezentat scăderi ale FV/FM la 48 și 72 h de expunere (P -1 a prezentat scăderea FV/FM (P Figura2 2 ).

fotosintezei

Cursurile de timp ale concentrațiilor de pigment (clorofil total și carotenoizi), rezerva de plastochinone (PQ) și conductanța stomatală (gs) în frunzele plantelor Salix miyabeana (cultivar SX64) răspândite cu doze crescute (0, 1,4, 2,1 și 2,8 kg ae ha -1) ratele erbicidului pe bază de glifosat (Factor ® 540). Valorile sunt media ± SE a trei replici.

Cursuri de timp ale măsurătorilor legate de fotosinteză [rata maximă de transport a electronilor (ETRmax), iradianța minimă de saturație (Ik), stingerea fotochimică (qP), stingerea non-fotochimică (NPQ), fluorescența relativă nestinsă (UQFrel) și eficiența fotochimică maximă a PSII (FV/FM)] în frunzele plantelor Salix miyabeana (cultivar SX64) răspândite cu doze crescute (0, 1,4, 2,1 și 2,8 kg ae ha -1) rate ale erbicidului pe bază de glifosat (Factor ® 540). Valorile sunt media ± SE a trei replici.

Conținut Shikimate și Proline

Concentrațiile de shikimate și proline în frunzele plantelor tratate cu erbicide au fost întotdeauna mai mari decât martorul (P Figura 3 3 ). La plantele expuse la 2,1 și 2,8 kg e.e ha -1, s-a constatat o acumulare importantă de shikimate după 72 de ore de tratare a erbicidelor (P -1) ratele erbicidului pe bază de glifosat (Factor ® 540). Valorile sunt media ± SE a trei replici.

Conținutul H2O2 și peroxidarea lipidelor

În comparație cu martorul, concentrația de H2O2 a fost întotdeauna mai mare la plantele expuse erbicidului (P Figura 3 3 ), și a crescut foarte mult la aceste plante după 72 de ore (P Figura 3 3 ). În toate plantele, conținutul de MDA a crescut ușor la 24 de ore (P> 0,05). Cu toate acestea, la plantele tratate cu erbicid, a fost observată o creștere pronunțată a concentrației de MDA la 72 de ore (P Figura 4 4 ). Am constatat că: (1) Activitățile SOD și APX au fost mai mari la plantele tratate cu erbicide până la 24 de ore (P Figura 5 5 ) am constatat că, în raport cu martorul: (1) concentrațiile totale de ascorbat (AsA + DHA) au fost mai mari la plantele tratate cu erbicide până la 24 de ore de expunere și apoi au fost reduse pentru următoarele rate de expunere (P -1) erbicidului pe bază de glifosat (Factor ® 540). Valorile sunt media ± SE a trei replici.

Cursuri de timp de ascorbat total (AsA + DHA), ascorbat redus (AsA), ascorbat oxidat (DHA) și raport AsA/DHA în frunzele plantelor Salix miyabeana (cultivar SX64) răspândite cu doze crescute (0, 1,4, 2,1 și 2,8 kg ae ha -1) rate ale erbicidului pe bază de glifosat (Factor ® 540). Valorile sunt media ± SE a trei replici.

Discuţie

În acest studiu, pentru prima dată, a fost făcută o investigație amplă a impactului erbicidului pe bază de glifosat asupra mai multor procese fiziologice. Am demonstrat că acest tip de erbicid a afectat nu numai calea shikimatei, ci mai multe procese fiziologice la plantele de salcie, așa cum au fost raportate anterior de Gomes și colab. (2016b). Figura Figura 6 6 reprezintă un model integrativ care interconectează parametrii fiziologici studiați (în special, calea shikimatei, procesele fotosintetice și evenimentele oxidative) afectate de expunerea la un erbicid pe bază de glifosat mai mare de 24 de ore (48 și 72 de ore). Diferitele etape ale acestui model sunt identificate de-a lungul textului ca fiind Figura Figura 6 6 , # 1-19.

Model interconectat al efectelor erbicidului pe bază de glifosat (Factor ® 540) asupra căii shikimate, fotosinteză și markeri oxidativi ai plantelor de salcie. Numerele se referă la cele menționate în discuție. ABA, acid abscizic; ALA, acid δ-aminolevulinic; APX, ascorbat peroxidază; AsA, ascorbat; EPSPS, 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfat sintază; ETR, rata de transport a electronilor; FV/FM, eficiență fotochimică maximă PSII; GPX, glutation peroxidază; gs, conductanța stomatală; H2O2, peroxid; Ik, iradiere minimă de saturație; MDA, peroxidarea lipidelor; NPQ, stingerea non-fotochimică; qP, stingere fotochimică; SOD, superoxid dismutază; UQFrel, fluorescența relativă nestinsă. Informațiile bazate pe literatură în modele sunt exprimate în cuvinte cursive și în săgeți punctate. În timp ce datele observate obținute în prezentul studiu sunt introduse în model ca cuvinte îndrăznețe și săgeți fără puncte.

De asemenea, am observat un răspuns interesant al activității GR la 48 și 72 de ore, deoarece activitatea sa nu a fost redusă semnificativ de expunerea la erbicide pe bază de glifosat. GR este legat de activitatea APX și GPX prin ciclul glutation-ascorbat (Foyer și Noctor, 2011). Cu toate acestea, după cum sa menționat, activitatea GR nu a urmat modelele APX și GPX la expunerea la erbicid. Menținerea activității GR în plantele tratate indică faptul că activitățile APX și GPX nu au fost limitate de disponibilitatea substratului, întărind că deteriorarea oxidativă propusă (carbonilarea proteinelor) a enzimelor ar putea fi responsabilă pentru degenerarea lor. Putem face ipoteza că, în mod similar producției de prolină, activitatea GR mai mare dependentă de NADP (H) poate favoriza OPPP și poate contribui ca sursă de NADP + pentru fotochimie.

Contribuțiile autorului

MG, SL a efectuat experimentele; MG, MLa și PJ au conceput experimentele; MG și PJ au scris lucrarea; LH-E și MLu au oferit suport tehnic și sfaturi conceptuale.

Declarație privind conflictul de interese

Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricărei relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretată ca un potențial conflict de interese.