Departamentul de afiliere pentru fiziologie clinică, Facultatea de Medicină Veterinară, Universitatea Warmia și Mazury din Olsztyn, Olsztyn, Polonia
Departamentul de afiliere pentru fiziologie clinică, Facultatea de Medicină Veterinară, Universitatea Warmia și Mazury din Olsztyn, Olsztyn, Polonia
Cifre
Abstract
Citare: Palus K, Całka J (2015) Influența gastritei induse de suplimentarea acidului acetilsalicilic asupra neurochimiei neuronilor simpatici care furnizează regiunea prepilorică a stomacului porcin. PLoS ONE 10 (11): e0143661. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0143661
Editor: Michael Bader, Centrul de Medicină Moleculară Max-Delbrück (MDC), GERMANIA
Primit: 16 august 2015; Admis: 6 noiembrie 2015; Publicat: 25 noiembrie 2015
Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se găsesc în lucrare.
Finanțarea: Publicație susținută de Comitetul de stat polonez pentru cercetare științifică numărul 1890/B/P01/2010/39, acordul acordat de Universitatea Warmia și Mazury din Olsztyn (cercetare legală) nr. 15.610.003-300 și consorțiul științific KNOW (Leading National Research Center) „Animal sănătos - hrană sigură”, decizia Ministerului Științei și Învățământului Superior Nr. 05-1/KNOW2/2015.
Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.
Introducere
Ultimii treizeci de ani au arătat progrese din ce în ce mai rapide în studiile de inervație a tractului gastro-intestinal. În general, stomacul și intestinul sunt inervați de ambii neuroni aflați în ganglionii intramurali și aparțin astfel sistemului nervos enteric (ENS) [1, 2], precum și de corpurile celulare extrinseci originare din ganglionii simpatici, parasimpatici și senzoriali [ 3–5]. Investigațiile recente au arătat că ganglionii simpatici nu sunt doar centre de integrare nervoasă, ci și posesia unor proprietăți importante de către neuronii lor. Printre altele includ convergența impulsurilor centrale, proiecția impulsurilor viscerale la nivelurile pre- și post-sinaptice, accesarea/permiterea fibrelor centrale de protecție viscerală și a activității stimulatorului cardiac [6, 7]. Cu toate acestea, neuronii postganglionari simpatici care alimentează tractul gastro-intestinal nu influențează în mod direct funcțiile acestuia, ci își exercită efectele prin ENS [8, 9] sau constrâng arterele care furnizează organul digestiv [10]. Mai mult, funcția stomacului este mediată și modulată de o mulțime de transmițătoare neuronale și neuropeptide, care joacă un rol în reglarea motilității, secreției acide, eliberării hormonilor, fluxului sanguin local și mecanismelor de apărare a mucoasei [3].
Există un volum mare de studii publicate care descriu inervația simpatică a stomacului, bazată în principal pe animale mici de laborator, cum ar fi șobolan [10-12], șoareci [13, 14], cobai [15, 16], iepure [17] sau animale domestice, cum ar fi câinele [7] și pisica [18, 19]. Autorii raportează că ganglionii povertebrali, de ex. ganglionul celiac constituie principala sursă de inervație simpatică postganglionară a viscerelor abdominale. În timp ce în ganglionii paravertebrali, de exemplu, s-au găsit doar perikarya unice. ganglionii lanțului simpatic [16, 20]. Până în prezent, se știe relativ puțin despre inervația stomacului la porcul domestic, care seamănă foarte mult cu cea la om în ceea ce privește caracteristicile anatomice și fiziologice [21, 22]. Studiile anterioare din domeniu descriu doar inervația extrinsecă a intestinului subțire și gros [4, 20] sau se concentrează asupra sistemului nervos enteric [23, 24].
Sistemul nervos autonom se caracterizează prin plasticitate ridicată ca răspuns la diferiți stimuli patologici și prin capacitatea de adaptare la condițiile de mediu în schimbare [25, 26]. Această adaptare implică schimbarea fenotipului chimic al neuronilor prin expresia crescută a unor neurotransmițători și redusă de alții sau prin activarea expresiei genelor inactive anterior [26, 27]. În ultimii ani, a existat o cantitate din ce în ce mai mare de literatură care descrie modificarea codificării chimice a neuronilor simpatici care furnizează tractul gastro-intestinal în timpul ileitei [20], a enteropatiei proliferative [28], a colitei [4] și a axotomiei [29-31]. În plus, unii autori sugerează că neuronii simpatici nu numai că își schimbă caracteristica chimică, dar prezintă și capacitatea de regenerare [32]. Interesant este că unii autori sugerează că sistemul nervos simpatic joacă un rol de modulator al inflamației gastrointestinale, deoarece neuronii simpatici furnizează țesuturi limfoide. Mai mult, prezența receptorilor pentru neurotransmițătorii simpatici în celulele imune a fost confirmată [33].
Prin urmare, acest experiment a fost conceput pentru a stabili: 1) localizarea și distribuția neuronilor simpatici care furnizează zona prepilorică a stomacului la porcii domestici; 2) fenotipul neurochimic al perykariei trasate în stare fiziologică; 3) posibile modificări ale codificării neurochimice a neuronilor urmăriți în timpul gastritei indusă de suplimentarea prelungită cu acid acetilsalicilic.
Materiale și metode
Declarație de etică
Procedura experimentală, inclusiv eutanasierea animalelor, a fost aprobată de Comisia etică locală pentru experimente pe animale de la Universitatea din Warmia nad Mazury din Olsztyn (numerele permisului 05/2010). Toate intervențiile chirurgicale au fost efectuate sub anestezie tiopentală de sodiu și s-au făcut toate eforturile posibile pentru a reduce la minimum suferința animalelor.
Animale și proceduri chirurgicale
Ulterior, porcii au fost repartizați aleatoriu în una din cele două grupuri experimentale: control (grup C, n = 5) și grup ASA (n = 5). Animalelor care au constituit grupul ASA, din a șaptea zi după injectarea FB, li s-a administrat acid acetilsalicilic pe cale orală (aspirină, BAYER; 100 mg/kg corp), cu 1 oră înainte de hrănire. Examenul gastroscopic a fost efectuat pentru a exclude leziunile din mucoasa gastrică la animalele din grupul ASA în prima zi și pentru a confirma gastrita cauzată de ASA - tratament în ultima zi de suplimentare cu aspirină (folosind un video-endoscop Olympus GIF 145 cu lungime de lucru 1030 mm și diametru 9,8 mm).
După un timp de supraviețuire de 4 săptămâni (a 21-a zi de tratament cu ASA), atât porcii de control, cât și porcii ASA au fost reanesteziați profund și sacrificați printr-o supradoză de tiopental de sodiu. Apoi, acestea au fost perfuzate transcardic cu paraformaldehidă tamponată 4% (pH 7,4). Gastrita la animalele din grupul ASA a fost confirmată prin examinarea histopatologică a fragmentelor din peretele stomacului prepiloric colectate după perfuzie (folosind metode histopatologice de rutină). Ulterior perfuziei, au fost colectate următoarele țesuturi: complexul ganglionar mezenteric celiac-cranian (CCMG) (cunoscut și sub numele de complexul ganglionar mezenteric celiac-superior (CSMG)); ganglionii lanțului simpatic toracic, lombar și sacru (SChG), ganglionii cervicali și cranieni mijlocii, ganglionii suprarenali, ganglionii mici ai plexurilor intermesenterice și renale, ganglionii mezenterici caudali (CaMG). Țesuturile colectate au fost post-fixate prin imersiune în același fixativ timp de 20 de minute, clătite în tampon fosfat (pH 7,4) timp de trei zile și în cele din urmă au fost depozitate în soluție de zaharoză tamponată 30% până când s-au scufundat la fundul recipientului pentru prelucrare ulterioară.
Imunohistochimie și statistici
Comenzi standard, adică preabsorbție pentru antiserurile neuropeptidice cu antigen adecvat (20 μg de antigen/ml diluat de antiser, toate antigenele achiziționate de la Peninsula, Sigma sau AbD Serotec) și omiterea, precum și înlocuirea tuturor antiserurilor primare cu seruri neimune au fost efectuate pentru a testa etichetarea imunohistochimică. Nu a fost observată fluorescență în toate aceste colorări de control, ceea ce confirmă specificitatea metodologiei și anticorpului aplicat.
Secțiunile au fost apoi examinate la microscopul Olympus BX51, echipat cu filtre potrivite pentru AlexaFluor 488, AlexaFluor 546 și Fast Blue, iar imaginile au fost capturate de o cameră digitală conectată la un computer, echipată cu software-ul de analiză a imaginii Olympus Cell F (Olympus, Tokyo, Japonia). Secțiunile colorate pentru aceeași combinație de antigene atribuite investigațiilor cantitative au fost separate cu cel puțin 100 μm, pentru a evita dubla analiză a somatelor neuronale. Numărul de perikarya FB-pozitiv numărat pentru fiecare combinație de anticorpi a fost peste 200 de neuroni per animal. Datele din ambele grupuri au fost combinate, analizate statistic folosind software-ul Statistica 10 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, SUA) și au fost prezentate ca o medie ± eroare standard de medie (SEM). Diferențele semnificative au fost evaluate utilizând testul t Student pentru probe independente (* P Tabelul 2. Densitatea fibrelor nervoase care înconjoară perykarya FB-pozitivă în complexul CCMG imunoreactiv pentru substanțe specifice.
Micrografii fluorescente care prezintă neuroni marcați FB (A, E, I, M, R) în CCMG porcină a animalelor martor simultan imunoreactive la DβH (B) și TH (C), NPY (F) și TH (G) și GAL (J) și TH (K). Fotografia N prezintă fibre nNOS-IR (vârfuri de săgeți) în imediata apropiere a neuronilor marcați FB, în timp ce fotografia (S) a dezvăluit o rețea densă de fibre LENK-IR (vârfuri de săgeți) care înconjoară somate marcate cu FB. Fotografiile D, H, L, P și U au fost create prin suprapunerea digitală a trei canale color.
Micrografii fluorescente care prezintă imunoreactivitatea TH (C, G, K, O, T) în neuronii CCMG marcați FB (A, E, I, M) ai animalelor martor și CART-IR (B), CGRP-IR (F), Fibre nervoase SP-IR (J), VIP-IR (N) (vârfuri de săgeți) în imediata apropiere a corpurilor celulare marcate cu FB. Fotografiile D, H, L și P au fost create prin suprapunerea digitală a trei canale color.
Gastrita indusă de suplimentarea prelungită cu acid acetilsalicilic a schimbat modelele de codificare ale multor celule FB +. Populația de celule TH-pozitive și DβH-pozitive a fost redusă (Tabelul 3). Examinarea microscopică a secțiunilor a arătat că 85,78 ± 2,65% au fost TH-pozitive, în timp ce 88,82 ± 1,63% din neuronii urmăriți de FB au exprimat imunoreactivitate DβH (Fig. 3A, 3B, 3C și 3D). În plus, reglarea în sus a neuronilor NPY-IR la 76,59 ± 3,02% a fost, de asemenea, semnificativă statistic (Fig. 3E, 3F, 3G și 3H). Cea mai remarcabilă diferență în codificarea chimică a neuronilor simpatici urmăriți între porcii martori și tratați cu ASA a inclus un număr foarte crescut de GAL (până la 26,45 ± 2,75%) (Fig. 3I, 3J, 3K și 3L). Celulele FB-pozitive care conțin GAL au fost, de asemenea, furnizate de numeroase fibre nervoase GAL-IR varicoase. Mai mult, celulele care conțin nNOS în 6,13 ± 1,11% (Fig. 3M, 3N, 3O și 3P) și LENK în 4,77 ± 0,42% (Fig. 3R, 3S, 3T și 3U) au fost observate numai la animalele tratate cu ASA. Similar animalelor de control, perikarya trasată nu a fost imunoreactivă la CART, CGRP, SP și VIP, dar fibrele nervoase care conțin acești neurotransmițători au fost observate în imediata apropiere a somatelor marcate cu FB și seamănă cu cele observate în grupul de control.
Micrografii fluorescente care prezintă modificări ale imurectivității neuronilor marcați FB (A, E, I, M, R) în CCMG porcină a animalelor tratate cu ASA. Fotografiile C, G, K, O și T prezintă neuroni imunoreactivi la TH și simultan la DβH (B), NPY (F), GAL (J), nNOS (N) și LENK (S). Fotografiile D, H, L, P și U au fost create prin suprapunerea digitală a trei canale color. Singurele perikarya conținând TH/DβH (B, C), spre deosebire de două din grupul martor (Fig. 1B și 1C), erau vizibile. Mai mult, a fost observată creșterea numărului de neuroni GAL-IR (J) și NPY-IR (F) și a fost detectată sinteza novo a nNOS (N) și LENK (S).
Examen gastroscopic și histopatologic
Examenul gastroscopic efectuat în prima zi a experimentului a exclus leziunile din mucoasa gastrică la animale atât din grupul de control, cât și din grupul ASA. Cu toate acestea, aceeași examinare efectuată în ultima zi a confirmat gastrita cauzată de suplimentarea cu acid acetilsalicilic. Modificări macroscopice, cum ar fi: hiperaemia, petechia, eroziuni superficiale și ulcere mici au fost observate nu numai în mucoasa gastrică, ci și în duoden. Evaluarea histopatologică a fragmentelor din peretele regiunii prepilorice gastrice a dezvăluit modificări microscopice, cum ar fi: hiperaemia mucoasei, eroziuni profunde, foliculoză, proliferarea neutrofilelor și infiltrarea eozinofilă care se extinde în submucoasă (Fig 4A, 4B, 4C și 4D).
Modificări histopatologice ale membranei mucoasei gastrice cauzate de suplimentarea cu acid acetilsalicilic: eroziuni superficiale (săgeți) ale mucoasei gastrice (A, B), hiperaemie (săgeți) în mucoasa gastrică (C, D), infiltrarea eozinofilelor (săgeți) în mucoasa gastrică ( E) și proliferarea celulelor limfatice (săgeți) în mucoasa gastrică (F).
Discuţie
În ciuda faptului că inflamația mucoasei gastrice, cauzată de suplimentarea pe termen lung cu acid acetilsalicilic, nu are nicio influență asupra numărului de neuroni care inervează zona studiată a stomacului, celulele simpatice marcate retrograd prezintă o mare plasticitate în fenotipul lor neuropeptidic. . Gastrita indusă de ASA a condus la modificări semnificative în codificarea chimică a neuronilor urmăriți, prin reducerea producției enzimelor tractului de sinteză a catecolaminei și reglarea în sus a sintezei neuropeptidelor implicate în mecanismele de apărare neuronală (NPY, GAL, nNOS, LENK). Aceste date sunt în acord cu faptul că regenerarea neuronilor simpatici reglează temporar expresia unor neurotransmițători în special TH [32] și încep să producă neurotransmițători implicați în apărare și supraviețuire [31].
Leu 5-encefalina (LENK) este un neurotransmițător peptidic opioid endogen detectat în tractul gastro-intestinal în celulele endocrine și neuroni ai ENS, precum și neuroni extrinseci [55]. Experimentele la șobolani au descris că opioidele endogene sunt eliberate în anumite zone ale creierului ca răspuns la diferiți stimuli stresanți și modulează nocicepția. Mai mult, LENK poate fi secretat de leucocite și prin activarea receptorilor senzitivi opioizi și poate duce la inhibarea durerii inflamatorii locale [78]. Rezultatele sintezei de novo a LENK în neuronii CCMG în gastrita indusă de ASA pot implica acest opioid în răspunsul neuronal la procesul inflamator. Într-adevăr, fibrele nervoase simpatice și senzoriale reglează în sus expresia ICAM-1 endotelial vascular, ducând la activarea leucocitelor care conțin peptide opioide și reduc durerea inflamatorie [78]. Cu toate acestea, unele dintre studiile experimentale pe diferite modele animale de inflamație prezintă expresia scăzută a LENK în structurile neuronale și non-neuronale [28, 79]. Deși datele din literatura de specialitate și rezultatele acestui studiu sugerează că LENK este implicat în reglarea durerii inflamatorii, sunt necesare investigații ultrastructurale și funcționale suplimentare pentru a explica aceste mecanisme.
În concluzie, datele obținute au arătat că fibrele nervoase simpatice postganglionare care furnizează zona prepilorică a stomacului porcin provin din complexul CCMG. Neuronii urmăriți retrograd conțineau TH, DβH, NPY și GAL, ceea ce poate sugera implicarea lor în reglarea simpatică a funcției gastrice. Gastrita indusă de ASA a dus la o expresie crescută a NPY și GAL, precum și la noua sinteză a nNOS și LENK în neuroni CCMG urmăriți. Rezultatele prezentului studiu indică implicarea acestor neuropeptide în dezvoltarea și probabil contracararea inflamației gastrice. În plus, rețeaua de fibre nervoase CART-, CGRP-, SP-, VIP-, LENK-, nNOS- IR care înconjoară/pericariile FB-pozitive învecinate, observate atât la animalele intacte, cât și la cele tratate cu ASA, sugerează că aceste neuropeptide pot avea rol de transmițător cu acțiune indirectă, precum și modulatori ai controlului simpatic al funcției gastrice la porc.
Contribuțiile autorului
Conceput și proiectat experimentele: KP JC. A efectuat experimentele: KP. Analiza datelor: KP JC. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: KP JC. Am scris lucrarea: KP.