Contribuție de Andrew V. Schally

hormonului

Abstract

MATERIALE ȘI METODE

Peptidă și reactivi.

Antagonist GH-RH (MZ-5-156) PhAc- [D-Arg 2, Phe (p-Cl) 6, Abu 15, Nle 27] hGH-RH (1-28) Agm [unde PhAc este fenilacetil, Phe ( p-Cl) este paraclor-fenilalanil, Abu este α-aminoisobutiril, Nle este norleucil, iar Agm este agmatină] a fost sintetizată prin metode în fază solidă și purificată în laboratorul nostru (20). Pentru injecțiile zilnice, MZ-5-156 a fost dizolvat în 0,1% dimetil sulfoxid (DMSO) în 10% propilen glicol/soluție salină sterilă (Sigma).

Animale.

Șoarecii nud masculi atimici (Ncr nu/nu), cu vârsta de aproximativ 6 săptămâni la sosire, au fost obținuți de la Institutul Național al Cancerului (Bethesda, MD) și găzduiți în dulapuri cu flux de aer laminar în condiții fără patogeni, cu o lumină de 12 ore/12- h program întunecat și hrănit autoclav standard chow și apă ad libitum. Îngrijirea lor era în concordanță cu orientările instituționale.

Cultură de celule.

Linia DU-145 de carcinom de prostată independent de androgen uman a fost obținută din colecția American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celulele DU-145 au fost cultivate sub formă de monostrat în mediu RPMI 1640 (GIBCO) suplimentat cu 10% ser fetal bovin, antibiotice și antimicotice la 37 ° C într-o atmosferă umidificată 95% aer/5% CO2 atmosferă. Celulele tumorale care au crescut exponențial au fost recoltate prin incubare scurtă cu soluție de tripsină-EDTA 0,25% (GIBCO). Xenogrefele de DU-145 au fost inițiate de s.c. injectarea a 1 × 107 celule în flancurile stângi a cinci șoareci nud masculi.

Protocol experimental.

Tumorile DU-145 rezultate după 8 săptămâni de creștere au fost disecate aseptic și tocate mecanic; 3-mm 3 bucăți din fiecare țesut tumoral au fost transplantate s.c. prin ac trocar în șoareci masculi nud sub anestezie metoxifluran (Methofane, Pitman-Moore, Mundelein, IL). La șase săptămâni după transplant, când tumorile crescuseră până la un volum cuprins între 40 și 50 mm 3, șoarecii purtători de tumori au fost împărțiți în două grupuri de câte opt animale fiecare. Grupul martor a fost injectat numai cu 0,1% DMSO în 10% propilen glicol/soluție salină s.c. (soluție vehicul) și grupul experimental a fost tratat cu 20 μg de antagonist GH-RH MZ-5-156 s.c. de doua ori pe zi. Tratamentul a fost continuat timp de 8 săptămâni. Tumorile au fost măsurate o dată pe săptămână cu microcalipere, iar volumul tumorii a fost calculat ca lungime × lățime × înălțime × 0,5236 (25). La sfârșitul experimentului, șoarecii au fost anesteziați cu metoxifluran și sacrificați prin decapitare, iar sângele din trunchi a fost colectat. Serul a fost separat și analizat prin radioimunotest. S-au înregistrat greutăți corporale și tumorile au fost disecate, curățate și cântărite cu atenție, iar probele fiecărei tumori au fost luate pentru analize radioimunologice și biologie moleculară.

Test radioimono pentru IGF-I și IGF-II.

Extragerea ARN-ului.

ARN-ul total a fost extras din tumorile DU-145 umane utilizând RNAzolJ B (Tel-Test, Friendswood, TX) conform instrucțiunilor producătorului. Peletele de ARN au fost suspendate în 50 μl de tampon 10 mM Tris/1 mM EDTA (pH 8,0) și cuantificate spectrofotometric la 260 nm.

Transcriere inversă - PCR (RT-PCR).

Primeri oligonucleotidici utilizați în analiza RT-PCR pentru expresia mARN-ului IGF-I, IGF-II și β-actină umană în tumorile de prostată umane DU-145 independente de androgen

Analiza Southern Blot.

După electroforeză, gelul a fost tratat cu tampon de denaturare, apoi prin tampon de neutralizare, produsele PCR au fost transferate la membrana Hybond N + prin transfer capilar, iar ADNc a fost legat de acesta prin încălzire timp de 2 ore la 80 ° C. Prehibridizarea a fost realizată la 37 ° C timp de 4 ore într-un tampon conținând 50% formamidă, 1 M NaCI, 1% SDS și 100 μg/ml ADN de somon denaturat și sonicat. Membrana a fost apoi hibridizată într-un tampon de prehibridare care conține ADNc IGF-II (1 kbp) sau 32 ADN-β-actină (1,1 kbp) marcat cu 32 P uman. Ambele ADNc au fost achiziționate de la ATCC și au fost etichetate utilizând un sistem de etichetare multiprime (Amersham). Bloturile au fost spălate în condiții stricte, iar semnalele din probe au fost scanate și cuantificate folosind un densitometru de imagistică (Model GS-700, Bio-Rad).

Secvențierea ADNc.

Produsul PCR obținut după analiza RT-PCR utilizând primerii specifici pentru IGF-II a fost secvențiat prin utilizarea protocoalelor modificate ale chimiei ABI Big Dye Terminator (Genome Systems, St. Louis). Eșantionul de ADNc a fost analizat de B. Blakey prin utilizarea secvențiatorului ADN ABI Prism 337 la Genome Systems.

Analize statistice.

Toate valorile sunt exprimate ca medie ± SEM, iar analizele statistice au fost efectuate utilizând testul cu interval multiplu al lui Duncan.

REZULTATE

Efectul antagonistului GH-RH MZ-5-156 asupra creșterii tumorilor DU-145.

Volumul tumorii la șoarecii atimici care poartă DU-145 transplantat subcutanat de cancer de prostată uman independent de androgen după tratamentul cu antagonistul GH-RH MZ-5-156 administrat s.c. la o doză de 20 μg per animal de două ori pe zi (b.i.d.). Tratamentul a fost început atunci când tumorile au măsurat aproximativ 40-50 mm3 și au durat 8 săptămâni. Liniile verticale indică SEM. ∗, P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Nivelurile IGF-I și IGF-II în serul și țesutul tumoral al șoarecilor goi care poartă DU-145 xenogrefe de prostată umane independente de androgen la sfârșitul perioadei de tratament cu antagonistul GH-RH MZ-5-156

Efectul MZ-5-156 asupra expresiei ARNm IGF-II în tumorile DU-145.

Analiza RT-PCR a IGF-II umană (a) și a β-actinei (b) expresiei mARN în tumorile de prostată DU-145. Produsele PCR au fost separate prin electroforeză cu gel de agaroză 1,8% și colorate cu bromură de etidiu. Mărimile produselor PCR așteptate au fost de 538 și 518 pb pentru hIGF-II și, respectiv, hβ-actină. Benzi: M (marker de greutate moleculară), MX174 HaeIII digest; 1, control negativ; 2–6, probe de la animale netratate; 7-11, probe tumorale de la animale tratate cu antagonist GH-RH MZ-5-156.

Analiza Southern blot a ADNc pentru IGF-II uman (a) și β-actină (b) obținută după RT-PCR. Produsele PCR au fost separate prin electroforeză cu gel de agaroză 1,8% și transferate în membranele Hybond N +. Hibridizările au fost efectuate cu sonde ADNc specifice pentru hIGF-II sau hβ-actină. Bloturile au fost spălate în condiții stricte și expuse la autoradiografie. Numerotarea este la fel ca în Fig. 2.

Efectul antagonistului GH-RH MZ-5-156 asupra expresiei ARNm pentru IGF-II în DU-145 cancer de prostată uman independent de androgen. După densitometrie, nivelurile de mARN pentru hIGF-II au fost standardizate în funcție de nivelurile de mARN de hβ-actină și sunt exprimate ca procent din valoarea martor. ∗∗, P ‡ Căror solicitări de reimprimare trebuie adresate la: Veterans Affairs Medical Center, 1601 Perdido Street, New Orleans, LA 70146.

↵ § În concediu de la Departamentul de Anatomie Umană, Facultatea de Medicină Universitară din Pécs, Pécs, Ungaria.