Unitatea de Cercetare în Neuroștiințe, Spitalul Saint-Luc (C.H.U.M.), Universitatea din Montreal, Montreal, Quebec, Canada

Unitatea de Cercetare în Neuroștiințe, Spitalul Saint-Luc (C.H.U.M.), Universitatea din Montreal, Montreal, Quebec, Canada

Unitatea de Cercetare în Neuroștiințe, Spitalul Saint-Luc (C.H.U.M.), Universitatea din Montreal, Montreal, Quebec, Canada

Unitatea de Cercetare în Neuroștiințe, Spitalul Saint-Luc (C.H.U.M.), Universitatea din Montreal, Montreal, Quebec, Canada

Unitatea de Cercetare în Neuroștiințe, Spitalul Saint-Luc (C.H.U.M.), Universitatea din Montreal, Montreal, Quebec, Canada

Unitatea de Cercetare în Neuroștiințe, Spitalul Saint-Luc (C.H.U.M.), Universitatea din Montreal, Montreal, Quebec, Canada

Abstract

Abrevieri

Insuficiența hepatică acută (ALF) rezultată din infecția virală sau leziunile hepatice toxice este o afecțiune care pune viața în pericol. Ratele mortalității sunt extrem de ridicate, decesul rezultând predominant din hernia cerebrală datorată hipertensiunii intracraniene cauzate de edemul creierului. Există dovezi din ce în ce mai mari care sugerează că inflamația joacă un rol semnificativ în patogeneza edemului cerebral în ALF. De exemplu, prezența inflamației sistemice este asociată cu o progresie mai rapidă a encefalopatiei și a edemului cerebral la pacienții cu ALF (Rolando și colab. 2000). Inflamația sistemică în ALF are ca rezultat creșterea nivelurilor circulante de citokine proinflamatorii, inclusiv factorul de necroză tumorală alfa (TNF-α) și interleukinele (IL-1β, IL-6) și colab. 2000; Jalan și colab. 2004). Mai mult, studiile de diferență arterio-venoasă la pacienții cu ALF cu hipertensiune intracraniană necontrolată sugerează un eflux net de creier de TNF-α, Il-1β și IL-6 în concordanță cu producția crescută a creierului acestor citokine (Jalan și colab. 2003; Wright și colab. 2007). Cu toate acestea, lipsesc dovezi concludente pentru creșterea producției de citokine cerebrale în ALF.

Obiectivul prezentului studiu a fost de a evalua mecanismele inflamatorii ale creierului în ALF. În special, activarea microglială și expresia citokinelor proinflamatorii au fost măsurate ca o funcție a encefalopatiei și a severității edemului creierului utilizând un model animal bine caracterizat al ALF, șobolanul devascularizat hepatic (Bélanger și Butterworth 2005). În a doua serie de studii, efectele benefice ale minociclinei, o tetraciclină semisintetică care arată că limitează activarea microglială într-o gamă largă de condiții neurodegenerative (Stirling și colab. 2005), a fost investigat. Efectele minociclinei asupra progresiei encefalopatiei și edemului cerebral la șobolanii devascularizați hepatici au fost studiate în funcție de activarea microglială și de exprimare a citokinelor proinflamatorii. Activarea microglială a fost măsurată prin western blot (OX-6) și CD11b/c (OX-42) imunohistochimie.

Materiale și metode

Devascularizare hepatică și tratamente

Șobolanii Sprague-Dawley masculi adulți (200-250 g) cumpărați de la Charles River (Saint - Constant, Quebec, Canada) au fost testați în mod obișnuit pentru agenții patogeni obișnuiți și nu au fost infectați la începutul intervenției chirurgicale. Animalele au fost anesteziate cu izofluran și s-a efectuat o anastomoză portacavală de la un capăt la celălalt în conformitate cu liniile directoare ale lui Lee și Fisher (1961). Pe scurt, șobolanii au suferit o laparotomie, vena cavă inferioară și vena portă au fost izolate și fixate utilizând o clemă de anastomoză (Roboz Instruments Inc, Washington, DC, SUA) și o porțiune eliptică de 1,5 ori diametrul venei porte a fost îndepărtată. Vena portă a fost ligată și tăiată și s-a efectuat o anastomoză de la un capăt la altul la microscop de disecție. Timpul total al intervenției chirurgicale a fost Tabelul 1. Efectul minociclinei asupra progresiei encefalopatiei

Progresia encefalopatiei ALF - ALF salin - mino
Timpul până la pierderea reflexelor de îndreptare (h) 9,73 ± 0,23 13,09 ± 0,47 *
Timpul până la pierderea reflexelor corneene (h) 12,97 ± 0,36 15,84 ± 0,39 *
  • Timpul până la pierderea reflexelor de îndreptare și pierderea reflexelor corneene la șobolanii ALF tratați cu minociclină (ALF - mino) comparativ cu controalele ALF tratate cu soluție salină (ALF - soluție salină) exprimate în ore (h). Datele reprezintă media ± SEM de n = 10 animale pe grup de tratament; modificări semnificative în comparație cu grupul salin ALF indicat de *p

Măsurarea apei creierului

Apa din creier a fost cuantificată prin metoda greutate umedă/greutate uscată. Jumătate din creier a fost cântărită înainte și după 48 de ore de incubare într-un cuptor de 120 ° C. Conținutul de apă din probele de creier este exprimat ca procent din conținutul de apă conform următoarei ecuații:% Apă = (Greutate umedă - Greutate uscată)/Greutate umedă × 100.

Reacție în lanț în timp real cu transcripție a polimerazei (QRT - PCR)

Îndepărtarea LCR și test imunosorbent legat de enzime

Analiza Western blot

Imunohistochimie

analize statistice

Toate datele sunt exprimate ca medie ± SEM, iar analiza statistică a fost efectuată folosind elevul nepereche t‐Test (comparații în două grupuri) sau analiza unică a varianței (anova) urmată de Tukey’s post hoc analiză (comparații multiple). O probabilitate de p

Rezultate

Devascularizarea hepatică induce encefalopatia și edemul creierului

După HAL, șobolanii au dezvoltat o encefalopatie progresivă, începând cu letargie (evidentă la 6 ore după HAL) progresând către pierderea reflexelor corecte și cornee și a comei (Tabelul 1). Șobolanii operați cu rușine au prezentat comportament normal și reflexe neurologice pe toată durata experimentelor. Conținutul de apă din creier nu a fost semnificativ diferit între șobolanii acuzați de șobolan și șobolanii ALF la 6 ore după HAL (ALF - 6 h vs. șobolan: 78,23 ± 0,14% față de 78,09 ± 0,07%), dar a fost semnificativ crescut la șobolanii ALF în stadiul de coma (ALF-comă vs. fals: 80,78 ± 0,10% vs. 78,09 ± 0,07%, p

encefalopatie

Analiza Western blot a expresiei OX-6 la șobolani ALF relevă faptul că inhibarea activării microgliale prin tratamentul cu minociclină este corelată cu atenuarea edemului cerebral. (a) Procentul conținutului de apă din creier al cortexului cerebral provenit de la controalele simulate (fals), șobolani ALF la 6 ore după HAL (ALF - 6 ore), șobolani ALF în stadiul de comă a encefalopatiei (ALF - comă) și la șobolani ALF tratați cu minociclina (ALF - mino); (b) Expresia proteinei OX-6 în cortexul cerebral de la controalele simulate (benzi 1-3), șobolani ALF la 6 ore după HAL (benzi 4-6), șobolani ALF în stadiul de comă a encefalopatiei (benzi 7-9) și la șobolani ALF tratați cu minociclină (benzi 10-12); (c) Reprezentarea histogramei a expresiei OX-6 în diferitele grupuri de tratament. Datele reprezintă media ± SEM de n = 10 animale pe grup de tratament. Diferențe semnificative indicate de *p anova cu post hoc Testul lui Tukey).

Activarea microglială are loc în stadiul de comă al encefalopatiei și se corelează cu apariția edemului cerebral

Secțiunile corticale cerebrale plutitoare fixe de formaldehidă ale șobolanilor ALF colorate cu CD11b/c (OX-42) (Fig. 2a) prezintă activarea microgliei în stadiul de comă a encefalopatiei (ALF-COMA) comparativ cu controalele acționate în mod fals (SHAM). Creșteri comparabile ale numărului de celule OX - 42 - pozitive au fost observate și în talamus și hipocamp (Fig. 2b și Tabelul 2). Analiza Western blot a complexului major de histocompatibilitate antigen clasa II OX-6 în diferite momente de timp în timpul progresiei ALF relevă faptul că activarea microglială este corelată cu apariția edemului cerebral și a encefalopatiei severe (stadiu de comă) (ALF - comă). c).

Activarea microglială în creierul șobolanilor cu ALF rezultată din devascularizarea hepatică. Micrografii reprezentative care arată efectul ALF asupra (a) CD11b/c (OX-42) imunoreactivității în cortexul cerebral al controalelor acționate de simulări (SHAM) și șobolani ALF în stadiul de comă de enceflopatie (ALF - COMA) (mărire: 200 ×) și (b) colorarea OX-42 în cortexul cerebral, hipocampus și talamus de la șobolani ALF în stadiul de comă a encefalopatiei (mărire: 50 ×). Rețineți distribuția regională generalizată a imunocolorării OX-42.

Cortex frontal Thalamus Hippocampus
Comenzi acționate de rușine 28,5 ± 4,5 61,6 ± 4,0 41,0 ± 3,0
ALF - 6 ore 64,1 ± 3,7 * 97,3 ± 5,7 * 79,9 ± 4,0 *
ALF - comă 147,3 ± 7,6 * 163,1 ± 6,4 * 138,8 ± 7,2 *
ALF-mino 44,3 ± 2,8 ** 69,4 ± 4,4 ** 60,4 ± 2,2 **
  • OX - 42 - celule pozitive (per × 100 câmpuri optice) în regiunile cerebrale ale controalelor simulate, ALF - șobolani la 6 ore după HAL (ALF - 6 h), șobolani ALF în stadiul de comă a encefalopatiei (ALF - coma) și la șobolani ALF tratați cu minociclină (ALF - mino). Datele reprezintă media ± SEM a 10 măsurători pe animal (n = 6); diferențe semnificative indicate de *p anova cu testul post-hoc al lui Tukey).

Tratamentul cu minociclină ameliorează starea neurologică a șobolanilor ALF, previne edemul creierului și atenuează activarea microglială

În grupul ALF tratat cu ser fiziologic, șobolanii au pierdut progresiv reflexele de îndreptare (stadiul precoma) 9,7 ± 0,2 ore după HAL și au pierdut reflexele corneene (stadiul de coma) la 13,0 ± 0,4 ore după HAL. În comparație, minociclina - tratament semnificativ (p

Tratamentul cu minociclină atenuează reglarea în sus a expresiei IL-1β, IL-6 și TNF-α în creierul șobolan ALF

Nivelurile de proteine ​​IL-1β, IL-6 și TNF-α în LCR au fost crescute de 2,3 ori, 3,0 ori respectiv 2,1 ori, (p

Minociclina atenuează expresia creierului IL-1β, IL-6 și TNF-α la șobolani ALF. Nivelurile de proteine ​​IL-1β, IL-6 și TNF-α au fost determinate în CSF al controalelor acționate de simulări (sham), șobolani ALF 6 h post-HAL (ALF-6 h), în stadiul de comă a encefalopatiei (ALF-coma ).) și șobolani ALF tratați cu minociclină (ALF - mino). Datele reprezintă media ± SEM de n = 10 animale din fiecare grup. Diferențe semnificative indicate de *p † p anova cu post hoc Testul lui Tukey).

Minociclina atenuează expresia genei IL-1β, IL-6 și TNF-a creierului la șobolanii ALF. ARNm-urile citokinice au fost determinate în cortexul cerebral al controalelor acționate de fals (fals), șobolan ALF la 6 h post-HAL (ALF - 6 h), în stadiul de comă a encefalopatiei (ALF - comă) și șobolanilor ALF tratați cu minociclină (ALF - mino ). Datele reprezintă media ± SEM de n = 10 animale din fiecare grup. Diferențe semnificative indicate de *p anova cu post hoc Testul lui Tukey).

Tratamentul cu minociclină al animalelor de control simulate nu a avut niciun efect semnificativ asupra stării neurologice, a conținutului de apă din creier sau a nivelurilor de citokine ale LCR (Fig S1).

Discuţie

Encefalopatia hepatică în ALF este caracterizată atât de tulburări cognitive, cât și de somn, ambele putând rezulta din cauza citokinelor creierului crescute. De exemplu, supraexprimarea TNF-α și IL-1β în creier are ca rezultat o performanță slabă în sarcinile cognitive (Fiore și colab. 1996) și dereglarea somnului (Krueger și colab. 1998). Mai important, în contextul ALF, studiile anterioare arată că edemul creierului este corelat semnificativ cu prezența citokinelor proinflamatorii precum TNF-α și IL-1β (Allan și Rothwell 2001; Petty și Lo 2002) și rezultatele edemului cerebral tranzitoriu din rezultatele intracerebrale administrarea de IL-1β la șobolani normali (Holmin și Mathiesen 2000).

Așa cum era de așteptat din proprietățile sale antiinflamatorii (Yrjänheikki și colab. 1999; Tikka și colab. 2001; Wang și colab. 2005), rezultatele prezentului studiu demonstrează că tratamentul cu minociclină reduce activarea microglială și duce la scăderi semnificative ale expresiei IL-1β, IL-6 și TNF-α în creierul șobolanilor ALF. Mai mult, aceste efecte ale minociclinei au fost însoțite de scăderi semnificative ale conținutului de apă din creier, consolidând noțiunea că activarea microglială și acumularea de citokine inflamatorii în creier sunt implicate în patogeneza edemului cerebral în ALF. Aceste constatări sunt în conformitate cu rapoartele anterioare conform cărora tratamentul cu minociclină este eficient în limitarea edemului cerebral care însoțește hemoragiile intracerebrale (Wasserman și Schlichter 2007). Mai mult, edemul cerebral rezultat din hipoxia/ischemia experimentală este semnificativ redus la animalele cu deficit de receptor IL-1 (Lazovic și colab. 2005). Cu toate acestea, rezultatele prezentului studiu relevă faptul că o normalizare aproape completă a mRNA și proteinei IL-1β în urma tratamentului cu minociclină a dus la inhibarea semnificativă, dar incompletă, a edemului cerebral la animalele ALF, sugerând că ar putea fi implicate și alte citokine sau alte mecanisme fiziopatologice.

Rezultatele citokinelor creierului crescute sunt, în general, considerate a reflecta creșteri ale sintezei lor locale de către microglie sau celule endoteliale cerebrovasculare. Cu toate acestea, unele citokine pot fi transportate prin organe circumventriculare care nu au o barieră hematoencefalică (Maness și colab. 1998). Mai mult, a fost propusă și semnalizarea citokinelor aferente vagale sau simpatice, deși importanța acestei din urmă căi a fost pusă la îndoială (Licinio și Wong 1997). Nivelurile circulante de TNF-α și IL-1β sunt semnificativ crescute în ALF (Jalan și colab. 2002) și, deși investigațiile neuropatologice nu au evidențiat modificări semnificative ale barierei hematoencefalice în ALF (Kato și colab. 1992), intrarea citokinelor prin intermediul organelor circumventriculare rămâne o posibilitate. Mecanismele alternative (sau suplimentare) ar putea implica acumularea creierului de amoniac și lactat în ALF. Concentrația creierului de amoniac (Swain și colab. 1992b) și lactatul sunt corelate cu severitatea encefalopatiei (Therrien și colab. 1991; Zwingmann și colab. 2003) și modificările EEG (Deutz și colab. 1988) în ALF experimentale și concentrații relevante fiziopatologice de amoniac (Atanassov și colab. 1995) și lactat (Andersson și colab. 2005) s-a demonstrat că provoacă eliberarea de TNF-α și IL-1β din celule microgliene cultivate.

Constatările activării microgliale și creșterea citokinelor proinflamatorii cerebrale pot avea implicații importante pentru terapiile actuale și viitoare în ALF. Dializa cu albumina îmbunătățește starea neurologică la pacienții cu ALF și elimină citokinele circulante (Di Campli și colab. 2005) și hipotermia ușoară a demonstrat că reduce presiunea intracraniană la pacienții cu ALF (Jalan și colab. 1999) s-a arătat recent că scade concentrațiile cerebrale de TNF-α și IL-1β în ALF experimentale (Jiang și colab. 2005). Minociclina sa dovedit a fi eficientă în tratamentul sclerozei multiple în studiile clinice (Metz și colab. 2004). Cu toate acestea, utilizarea pe termen lung a minociclinei poate duce la afectarea ficatului (Lawrenson și colab. 2000), o proprietate care ar putea limita utilizarea sa în ALF. Sunt justificate studii terapeutice experimentale cu alți agenți antiinflamatori cu capacitatea de a limita activarea microglială și producerea creierului de citokine proinflamatorii în ALF.

Mulțumiri

Acest studiu a fost susținut de un grant de la Institutele canadiene de cercetare în domeniul sănătății. WJ este beneficiarul unei burse de cercetare de la Asociația canadiană pentru studiul ficatului.

Figura S1. Efectele minociclinei asupra conținutului de apă din creier și a citokinelor proinflamatorii în LCR a controalelor simulate.

Vă rugăm să rețineți: Wiley - Blackwell nu este responsabil pentru conținutul sau funcționalitatea materialelor suport furnizate de autori. Orice întrebare (alta decât materialul lipsă) trebuie să fie adresată autorului corespunzător pentru articol.

Descrierea numelui de fișier
JNC_5981_sm_Fig S1.ppt37 KB Element de informații de susținere

Vă rugăm să rețineți: editorul nu este responsabil pentru conținutul sau funcționalitatea oricăror informații de susținere furnizate de autori. Orice întrebări (altele decât conținutul lipsă) ar trebui să fie adresate autorului corespunzător pentru articol.