Kenichiro Takeuchi
1 Laboratoare de cercetare pentru siguranța medicamentelor, Astellas Pharma Inc., Yodogawa-ku, Osaka, Japonia.
Maki Ohishi
2 Institute for Advanced Bioscience, Universitatea Keio, Kakuganji, Tsuruoka, Yamagata, Japonia.
Keiko Endo
2 Institute for Advanced Bioscience, Universitatea Keio, Kakuganji, Tsuruoka, Yamagata, Japonia.
Kenichi Suzumura
3 Laboratoare de analiză și farmacocinetică, Astellas Pharma Inc., Miyukigaoka, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japonia.
Hitoshi Naraoka
1 Laboratoare de cercetare pentru siguranța medicamentelor, Astellas Pharma Inc., Yodogawa-ku, Osaka, Japonia.
Takeji Ohata
1 Laboratoare de cercetare pentru siguranța medicamentelor, Astellas Pharma Inc., Yodogawa-ku, Osaka, Japonia.
Jiro Seki
1 Laboratoare de cercetare pentru siguranța medicamentelor, Astellas Pharma Inc., Yodogawa-ku, Osaka, Japonia.
Yoichi Miyamae
1 Laboratoare de cercetare pentru siguranța medicamentelor, Astellas Pharma Inc., Yodogawa-ku, Osaka, Japonia.
Masashi Honma
4 Departamentul de Farmacie, Spitalul Universității din Tokyo, Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japonia.
Tomoyoshi Soga
2 Institute for Advanced Bioscience, Universitatea Keio, Kakuganji, Tsuruoka, Yamagata, Japonia.
Date asociate
Tabelul 2 suplimentar. Lista metaboliților sa schimbat în fiecare model.
Abstract
Simptomele gastrointestinale sunt o manifestare frecventă a efectelor adverse ale medicamentului. Medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene (AINS) sunt medicamente prescrise pe scară largă, care induc efectul secundar grav al ulcerării mucoasei gastrice. Nu au fost identificați biomarkeri pentru aceste reacții adverse, iar ulcerele sunt acum detectabile doar prin endoscopie. Am identificat anterior cinci metaboliți ca biomarkeri candidați pentru ulcerul gastric indus de AINS utilizând analiza metabolomică bazată pe electroforeză capilară - spectrometrie de masă (CE - MS) a serului și a stomacului de la șobolani. Aici, pentru a clarifica mecanismul modificărilor și limitărilor indicațiilor candidaților la biomarkeri, am efectuat profilarea metabolomică pe bază de CE - MS în stomac și ser de la șobolani cu ulcere gastrice induse de etanol, stres și aspirină. Rezultatele sugerează că o scădere a hidroxiprolinei reflectă inducerea leziunii gastrice și poate fi utilă în identificarea ulcerului gastric indus de cauze multiple. În timp ce extrapolarea la oameni necesită studii suplimentare, hidroxiprolina poate fi un nou biomarker seric al leziunii gastrice, indiferent de cauză.
Introducere
Plângerile gastro-intestinale sunt manifestări frecvente ale efectelor adverse ale medicamentului. 1 Medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene (AINS) sunt medicamente utile pentru o serie de afecțiuni, inclusiv artrita reumatoidă, osteoartrita și altele. Cu toate acestea, acestea au efecte adverse grave asupra mucoasei gastrice și s-a stabilit o asociere între utilizarea AINS și admiterea la spital pentru hemoragia și perforația gastro-intestinală superioară și alte evenimente gastro-intestinale superioare. Cu toate acestea, în prezent, ulcerarea gastrică și hemoragia sunt detectabile numai prin endoscopie4 și nu au fost identificate încă biomarkeri serici pentru ulcerul gastric indus de AINS.
Am raportat anterior cinci candidați biomarkeri în ser care prezic leziunile gastrice induse de AINS la șobolani. 5 De asemenea, am raportat că scăderea hidroxiprolinei în stomac indusă de aspirină s-a recuperat la nivelul de control la administrarea concomitentă cu omeprazol și famotidină. În schimb, nivelurile altor metaboliți din stomac nu s-au modificat la administrarea concomitentă cu acești agenți. 6 În ceea ce privește mecanismul schimbării, am speculat că modificările hidroxiprolinei s-au datorat unei scăderi induse de leziuni a cantității de colagen din țesutul stomacal, în timp ce cele din ceilalți metaboliți s-au datorat depresiei funcției mitocondriale induse de AINS. 6
Metabolomica este o tehnologie în evoluție rapidă, care identifică metaboliții sau căile metabolice care sunt modificate de patogeneza unei boli sau a unei leziuni prin comparație cu concentrațiile de metaboliți endogeni dintre pacienți și martori. Au fost utilizate mai multe metode analitice pentru a analiza concentrațiile de metaboliți endogeni, 12 - 16 inclusiv CE-MS. Această metodă oferă o analiză rapidă și o rezoluție eficientă, cu selectivitate și sensibilitate ridicate, și este un instrument puternic pentru analiza metabolomicii. 17 Eficacitatea acestei abordări este demonstrată de diferitele studii de identificare a biomarkerilor care au folosit-o. 18 - 20
Aici, pentru a clarifica mecanismul de schimbări și limitări ale candidaților biomarkeri identificați în leziunile gastrice induse de AINS, am aplicat o abordare metabolomică a puștii pe baza CE-time of flight (TOF) –MS profile ale metaboliților endogeni la modelele de șobolani de ulcer gastric induse de etanol, stres și aspirină. Am determinat apoi concentrațiile serice ale acestor biomarkeri.
Materiale și metode
Design de studiu
Șobolani Sprague-Dawley masculi au fost obținuți din Charles River Japonia (Yokohama, Japonia) și menținuți în condiții de mediu controlate, cu acces gratuit la o dietă cu pelete (CRF-1, Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Japonia) și robinet filtrat apă (conținând 2 ± 1 ppm fără clor ajustat cu hipoclorit de sodiu). După aclimatizare timp de trei zile, animalele au fost utilizate în studiu la vârsta de șase săptămâni și au cântărit 140-180 g.
Un total de 20 de animale (n = 8 animale pentru grupul de control, n = 4 animale pentru fiecare grup de tratament) au fost postite 24 de ore în cuști cu plasă de sârmă, dar au permis apă ad libitum și au fost atribuite unui grup de control (0,5% metilceluloză, po) sau unul dintre cele trei grupuri de tratament: (1) etanol cu doză unică (Nacalai Tesque, Kyoto, Japonia) la 5 ml/kg, po (model indus de etanol), (2) doză unică 0,5% metilceluloză, p.o. (model indus de stres), sau (3) aspirină cu doză unică (Nacalai Tesque, Kyoto, Japonia) la 300 mg/kg, p.o. (model indus de aspirină). Animalele alocate modelului indus de stres au fost ținute într-o cameră rece la 6 ° C timp de cinci ore după administrare.
Toate experimentele au fost efectuate la instalațiile Kashima ale Astellas Pharma Inc., cărora le-a fost acordat statutul de acreditare de către AAALAC International. Acest studiu a fost aprobat de Comitetul etic al animalelor din Astellas Pharma Inc. (Tokyo, Japonia).
Colectie de mostre
Șobolanii au fost anesteziați cu izofluran și exsanguinați prin aorta abdominală la cinci ore după administrare. Serul și stomacul au fost colectate în același mod ca și în studiul nostru anterior. 5 Interiorul stomacului a fost evaluat macroscopic, iar dimensiunile ulcerelor gastrice observate au fost determinate din fotografii utilizând software-ul de analiză a imaginii WinROOF (Mitani Corporation, Tokyo, Japonia). Toate probele au fost depozitate la -70 ° C până la prepararea probei.
Analiza concentrației de metaboliți
analize statistice
Pentru a identifica candidații biomarker, testul t nepereche (compararea mediilor a două probe cu varianță egală) a fost efectuat pentru grupuri de control și individuale pentru a găsi metaboliți care au prezentat modificări comune tuturor celor trei modele. Nivelurile de metabolit dintre grupuri au fost comparate folosind testul ANOVA și Dunnett folosind GraphPad Prism versiunea 5.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA).
Rezultate
Ulcerații gastrice
Severitatea ulcerației gastrice este prezentată ca o zonă ulcerativă pentru fiecare grup (Tabelul 1). Toate grupurile tratate au prezentat ulcerații gastrice. În schimb, nu s-a observat nicio ulcerație gastrică la animalele de control.
tabelul 1
Severitatea ulceratiei gastrice evaluata ca zona de ulceratie.
| Articol de testare | Vehicul | Etanol 5 mL/kg | Vehicul | Aspirină 300 mg/kg |
| Temperatura camerei (timp de 5 ore după administrare) | 19-25 ° C | 19 până la 25 ° C | 6 ° C | 19-25 ° C |
| Numărul de animale | 8 | 4 | 4 | 4 |
| Severitatea ulceratiei gastrice | ND (0/8) | 12,42 ± 5,90 (4/4) | 2,30 ± 1,47 (4/4) | 1,58 ± 1,60 (4/4) |
Note: Datele sunt exprimate ca medie + deviație standard a zonei de ulcerație (mm 2). Valorile din paranteze sunt rata de incidență a animalelor cu ulcerație gastrică.
Abreviere: ND, nu a fost detectat.
Analiza metabolomică a extractelor de țesut stomacal
Un total de 576 de vârfuri (tabelul suplimentar S1) au fost identificate și cuantificate cu standarde de metaboliți care corespund celei mai apropiate valori m/z și timp de migrație normalizat pentru comparații statistice suplimentare și interpretări folosind sistemul CE-TOF - MS. Deși s-au observat alți analiți anonimi, discutăm doar metaboliții identificați în prezentul studiu.
Metaboliții care au fost modificați în toate modelele sunt rezumați în tabelul 2, iar cei care au fost modificați în fiecare model sunt enumerați în tabelul suplimentar S2. În total, 57, 39 și 80 de metaboliți au fost modificați în modelele induse de etanol, stres și respectiv aspirină. O scădere a nivelului de hidroxiprolină și o creștere a celor de putrescină și N8-acetilspermidină au fost frecvent observate la toate modelele. Nivelurile acestor metaboliți în stomac sunt prezentate în Figura 1, iar electroferogramele lor ionice CE-TOF - MS selectate în Figura 2. Nivelurile de spermă, spermidină și N1-acetilspermidină, care sunt metaboliți înrudiți ai putrescinei și N8-acetilspermidinei, sunt prezentate în Figura 3. Aceste poliamine nu au crescut, cu excepția modelului indus de aspirină. Alți candidați biomarkeri raportați în studiul nostru anterior 5 nu au prezentat o schimbare similară în modelele de ulcer gastric indus de etanol și stres.
Nivelurile de hidroxiprolină, putrescină și N8-acetilspermidină în stomac.
Note: Datele sunt raportate ca medii ± deviație standard de patru sau opt animale pe grup. Asteriscurile indică diferențe semnificative statistic: ** P Figura 4. Analiza statistică a diferențelor cantitative între grupuri a arătat scăderi ale nivelurilor de hidroxiprolină la toate modelele. În schimb, modificările nivelurilor de putrescină nu au fost observate la toate modelele. Mai mult, concentrația serică de N8-acetilspermidină nu a fost determinată deoarece a fost sub limitele de detecție.
Nivelurile de hidroxiprolină, putrescină și N8-acetilspermidină în ser.
Note: Datele sunt raportate ca medii ± deviație standard de patru sau opt animale pe grup. Asteriscurile indică diferențe semnificative statistic: ** P 5 Am identificat o scădere a hidroxiprolinei ca un candidat comun și util pentru biomarker în toate cele trei modele. Având în vedere că această scădere reflectă inducerea ulcerului gastric și este monitorizabilă în ser, monitorizarea concentrațiilor serice de hidroxiprolină ar trebui să se dovedească utilă în identificarea inducției ulcerului gastric indiferent de cauză.
Creșteri ale nivelului de putrescină și N8-acetilspermidină au fost, de asemenea, frecvent observate la toate modelele. Putrescina este precursorul spermidinei și sperminei. Ei și derivații lor acetilați (N1- și N8-acetilspermidină) sunt considerați a fi distribuiți universal în celulele vii și s-a postulat că joacă roluri importante în controlul creșterii celulare. 27 S-a raportat producția crescută de spermină, spermidină și N1- și N8-acetilspermidină la locurile inflamatorii. 28, 29 Așa cum se arată în Figura 3, nivelurile de spermină și spermidină nu au fost crescute în modelele induse de etanol sau stres, iar N1-acetilspermidina a fost detectată numai în modelul indus de aspirină. Având în vedere că o creștere a putrescinei și N8-acetilspermidinei a fost, de asemenea, observată în mod clar în modelul indus de aspirină și că toți acești metaboliți s-au schimbat în același mod, se consideră că aceste modificări se corelează între ele și provin din aceeași cauză, inflamația gastrică.
Deși scăderea hidroxiprolinei a fost observată și în ser la toate cele trei modele, o creștere a putrescinei în ser nu a fost observată la toate modelele. Mai mult, concentrația serică de N8-acetilspermidină nu a putut fi determinată, deoarece a fost sub limitele de detecție în toate cele trei modele. Acest lucru indică faptul că, deși hidroxiprolina poate fi un biomarker seric pentru ulcerul gastric, putrescina și N8-acetilspermidina nu pot fi utilizate sau nu sunt sensibile în ser.
În concluzie, acest studiu a vizat clarificarea mecanismului de schimbare și limitare a indicațiilor candidaților biomarkeri pentru leziuni gastrice induse de AINS raportate în studiul nostru anterior 5 prin compararea profilurilor metabolice ale stomacului și serului obținute din etanol, stres și aspirină. modele induse de ulcer gastric, care au indus ulcerul gastric prin diferite mecanisme. Această abordare a relevat o scădere a nivelurilor de hidroxiprolină și o creștere a nivelurilor de putrescină și N8-acetilspermidină din extractele de stomac în toate modelele experimentale de ulcer gastric. În afară de hidroxiprolină, însă, niciunul dintre ceilalți candidați biomarkeri identificați anterior în modelul indus de aspirină nu s-a schimbat în același mod în modelele induse de etanol și stres. Mai mult, hidroxiprolina a fost singurul candidat care a prezentat o scădere a serului în toate cele trei modele. Prin urmare, concluzionăm că nivelul seric al hidroxiprolinei reflectă inducerea leziunii gastrice, indiferent de cauza leziunii.
Date suplimentare
Tabelul suplimentar 1. Lista metaboliților analizați.
Tabelul 2 suplimentar. Lista metaboliților sa schimbat în fiecare model.
- Expunerea maternă la bisfenol A și distanța anogenitală pe tot parcursul copilăriei Un studiu longitudinal
- Leann Birch, pionier în studiul comportamentelor alimentare ale copiilor și fost șef al departamentului ACES,
- Învățare Radiologie - gastric, stomac, diverticul, tic, radiologie, bariu
- Suplimentele pentru pastile dietetice Max Ten - Global Study UK
- McDonald; cu elemente din meniul lanțului Fast Food Study Study; Bacteriile stomacului