• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: koonin @ ncbi.nlm.nih.govtrk @ unitate.ncsu.edubcweimer @ cc.usu.edudamills @ ucdavis.edu
  • Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: koonin @ ncbi.nlm.nih.govtrk @ unitate.ncsu.edubcweimer @ cc.usu.edudamills @ ucdavis.edu
  • Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: koonin @ ncbi.nlm.nih.govtrk @ unitate.ncsu.edubcweimer @ cc.usu.edudamills @ ucdavis.edu

Contribuție de T. Klaenhammer, 16 august 2006

comparativă

Abstract

Bacteriile producătoare de acid lactic sunt asociate cu diverse nișe de plante și animale și joacă un rol cheie în producția de alimente și băuturi fermentate. Raportăm nouă secvențe de genom care reprezintă diversitatea filogenetică și funcțională a acestor bacterii. Micii genomi ai bacteriilor lactice codifică un repertoriu larg de transportori pentru o achiziție eficientă de carbon și azot din mediile bogate din punct de vedere nutrițional în care locuiesc și reflectă o gamă limitată de capacități biosintetice care indică atât tulpini prototrofe, cât și tulpini auxotrofe. Analizele filogenetice, compararea conținutului de gene în cadrul grupului și reconstrucția seturilor genetice ancestrale indică o combinație de pierderi genetice extinse și achiziții cheie de gene prin transfer orizontal de gene în timpul coevolutiei bacteriilor lactice cu habitatele lor.

Bacteriile lactice (LAB) sunt definite istoric ca un grup de organisme microaerofile, Gram-pozitive, care fermentează zaharurile hexozice pentru a produce în principal acid lactic. Această clasificare funcțională include o varietate de genuri importante din punct de vedere industrial, inclusiv specii Lactococcus, Enterococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Leuconostoc și Lactobacillus. Metabolismul aparent simplist al LAB a fost exploatat de-a lungul istoriei pentru conservarea alimentelor și băuturilor în aproape toate societățile care datează de la originile agriculturii (1). Domesticarea tulpinilor LAB transmise prin diferite tradiții culinare și trecerea continuă a produselor alimentare a dus la culturi moderne care sunt capabile să efectueze aceste fermentații. Astăzi, LAB joacă un rol important în aprovizionarea cu alimente la nivel mondial, realizând principalele bioconversii în produse lactate fermentate, carne și legume. LAB sunt, de asemenea, critice pentru producția de vin, cafea, siloz, cacao, aluat și numeroase fermentații alimentare indigene (2).

Speciile LAB sunt indigene în habitate legate de hrană, inclusiv medii de plante (fructe, legume și cereale) și de lapte. În plus, LAB-urile sunt asociate în mod natural cu suprafețele mucoasei animalelor, de exemplu, intestinul subțire, colonul și vaginul. Izolatele aceleiași specii sunt adesea obținute din habitate vegetale, lactate și animale, implicând o distribuție largă și adaptare specializată la aceste medii diverse. Speciile LAB folosesc două căi pentru metabolizarea hexozei: o cale homofermentativă în care acidul lactic este produsul primar și o cale heterofermentativă în care se produc acid lactic, CO2, acid acetic și/sau etanol (3).

Au fost publicate secvențe genomice complete pentru opt specii LAB fermentative și comensale: Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus salivarius și Streptococcus. Acest studiu examinează alte nouă genomi LAB care reprezintă diversitatea filogenetică și funcțională a microorganismelor producătoare de acid lactic. LAB are genomi mici care codifică o serie de capabilități biosintetice care reflectă atât caracterele prototrofe, cât și cele auxotrofe. Analizele filogenetice, compararea conținutului genomic în cadrul grupului și reconstrucția seturilor genetice ancestrale relevă o combinație de pierderi și câștiguri genetice în timpul coevoluției LAB cu animale și alimentele pe care le-au consumat.

Rezultate si discutii

Caracteristici generale ale genomilor LAB.

Caracteristicile majore ale genomului LAB secvențiat sunt rezumate în Tabelul 1, care este publicat ca informații de sprijin pe site-ul web PNAS. Numărul de gene prognozate care codifică proteinele din LAB diferă de la 7001.700 la ~ 2.800. Având în vedere relația filogenetică strânsă a acestor organisme, o astfel de diferență sugerează pierderea substanțială a genelor și/sau câștig în evoluția lor. În plus, toate genomurile LAB conțin pseudogene. În mod surprinzător, numărul pseudogenelor diferă cu un ordin de mărime, de la valorile bootstrap de 75%. Speciile sunt colorate conform taxonomiei actuale: Lactobacillaceae, albastru; Leuconostocaceae, magenta; Streptococcaceae, roșu.

Arborii filogenetici ai Lactobacillales construiți pe baza alinierilor concatenate ale proteinelor ribozomale. Toate ramurile sunt acceptate la valori de bootstrap> 75%. Speciile sunt colorate conform taxonomiei actuale: Lactobacillaceae, albastru; Leuconostocaceae, magenta; Streptococcaceae, roșu.

Un test de ceas molecular (19) a arătat o eterogenitate ridicată a ratelor evolutive în Lactobacillales. Majoritatea distanțelor de la rădăcină până la vârf sunt semnificativ inegale cu înălțimea medie a copacului; evoluția accelerată raportată anterior (20) a grupului Leuconostoc (cu un factor de 1,7-1,9 față de grupul suror Pediococcus) a fost deosebit de proeminentă.

Puterea selecției de purificare care acționează asupra speciilor Lactobacillales poate fi estimată prin utilizarea a două perechi strâns legate de genomi: Lb. gasseri/Lb. johnsonii și Lc. lactis/Lc. cremoris. Ratele de substituție sinonime și nesinonime au fost estimate din alinierea secvenței de codare concatenate a 443 gene ortoloage (142.031 codoni). Raportul dS/dN (distanță la site-uri sinonime/distanță la site-uri non-sinonime) a fost de 38,5 ± 0,5 pentru Lb. gasseri/Lb. perechea johnsonii și 29,8 ± 0,4 pentru Lc. lactis/Lc. pereche cremoris, care prezintă o presiune evolutivă neobișnuit de puternică în comparație cu Proteobacteria, care are un raport caracteristic dS/dN de 5-10 (21). Acest lucru este probabil să reflecte dimensiunea efectivă mare a populației și/sau rata mare de mutație a speciilor Lactobacillales, deoarece se știe că intensitatea selecției de purificare este proporțională cu aceste cantități (22).

Clustere de gene ortoloage în Lactobacillales.

Gene conservate și unice în genomul Lactobacillales. „Omolog” indică gene cu omologi detectabili în alte organisme decât cele analizate aici, dar nu au putut fi incluse în niciunul dintre seturile de COG. „Orfanii” sunt gene prezise fără omologi detectabili. Lacga, Lb. gazer; Lacbr, Lb. brevis; Pedpe, P. pentosaceus; Laccr, Lc. lactis ssp. cremoris; Strth, S. thermophilus; Oenoe, O. oeni; Leume, Le. mezenteroide; Lacca, Lb. cazuri; Lacde, Lb. delbrueckii; Lacla, Lc. lactis; Lacpl, Lb. plantarum; Lacjo, Lb. johnsonii. Axa verticală arată numărul de gene pe genom.

Ceas molecular local și HGT.

Reconstrucția câștigului și pierderii genei în evoluția lactobacilelor.

Reconstrucția evoluției conținutului genetic în Lactobacillales. Topologia arborelui este ca în Fig. 1, înrădăcinată folosind Baccillus subtilis ca grup outgroup. Pentru fiecare specie și fiecare nod intern al arborelui, este indicat numărul dedus de LaCOG-uri prezente și numărul de LaCOG-uri pierdute (albastre) și câștigate (roșii) de-a lungul ramurii care duce la nodul (specia) dat. Abrevierile sunt ca în Fig. 2.

În plus față de reducerea metabolică, o parte majoră a pierderii genelor la strămoșul comun al Lactobacillales au fost funcțiile legate de sporulație codificate de strămoșul comun al bacililor. În ciuda absenței genelor pentru sporulare, catalază și alte enzime cheie ale stresului oxidativ răspuns (de exemplu, superoxid dismutază) în 8 din cele 12 genomi analizați aici (posibil pierderi multiple), cel puțin unii lactobacili prezintă o rezistență sporită la stres. Această rezistență este demonstrată de recuperarea crescută a lactobacililor vii din alimentele uscate sub vid și iradiate (30) în comparație cu speciile stafilococice și Salmonella. Această rezistență poate fi mediată parțial de conținutul scăzut de fier, un oxidant puternic, care este însoțit de acumularea de mangan, un puternic antioxidant (31-33). O protecție suplimentară este probabil asigurată de alți antioxidanți, inclusiv glutation și γ-glutamilcisteină. Mai multe specii de Lactobacillus codifică o glutation sintetază bifuncțională (GshAB), în timp ce altele au doar γ-glutamilcisteină sintetază (GshA) (LaCOG01892). Cu toate acestea, s-a demonstrat că chiar și lactococii care nu pot sintetiza glutationul îl acumulează, aparent prin transport din mediu (34).

Comparația numărului de gene pierdute sau câștigate pe o anumită ramură de copac și lungimea ramurii corespunzătoare relevă un model similar cu cel descris anterior pentru Proteobacteria (43). Numărul pierderilor genetice (chiar și atunci când este normalizat de dimensiunea genomului ancestral) se corelează puternic și semnificativ cu lungimea ramurii determinată din divergența secvenței (R = 0,68; P −4), în timp ce numărul de gene câștigă (din nou, indiferent de normalizare) nu arată o astfel de corelație (R = 0,16; P> 0,1). Comportamentul asemănător ceasului al pierderii genelor este în concordanță cu un număr mare de evenimente la scară mică, care sunt distribuite aleatoriu de-a lungul căii evolutive. Acest model sugerează evoluția sub selecția purificatoare. În contrast, lipsa unei astfel de corelații pentru câștigul genelor pare să implice loturi relativ mari de gene dobândite la un moment dat, cu intervale mai mari între evenimentele de achiziție, probabil din cauza selecției pozitive.

În plus față de reconstrucția seturilor genetice ancestrale, am comparat organizațiile genomice ale tuturor genomurilor Lactobacillales secvențiate cu metodele de calcul dezvoltate anterior (44). Doar speciile strâns înrudite au prezentat o colinearitate semnificativă a genomului peste nivelul operonilor individuali și nu a existat practic nicio conservare la scară largă a ordinii genelor între cele patru grupuri majore ale Lactobacillales (datele nu sunt prezentate). Astfel, procesele de pierdere și achiziție a genelor în timpul evoluției acestor bacterii au fost însoțite de rearanjări extinse ale genomului.

Modele filetice și reconstrucție a metabolismului central.

Având în vedere proeminența metabolismului zahărului și a sistemelor de conversie a energiei în Lactobacillales, am examinat evoluția acestor sisteme prin tipare filetice, reflectând prezența sau absența genelor în genomii individuali într-un mod similar cu cel descris în ref. 45. Majoritatea genelor implicate în aceste funcții sunt reprezentate la toate speciile (Fig. 7 și Tabelul 7, care sunt publicate ca informații de sprijin pe site-ul web PNAS). Aceste gene includ cele care codifică partea din aval a glicolizei, de la gliceraldehidă-3P la piruvat și piruvat conversie la lactat și 2,3-butandiol; formarea acetatului din acetil-CoA; mai multe reacții ale căii pentoză-fosfat; și sistemul de fosfotransferază specifică pentru manoză. În mod clar, aceste enzime sunt insuficiente pentru a defini complet metabolismul oricărei specii individuale, iar mai multe reacții sunt specifice liniei individuale. Modelele de prezență/absență ale enzimelor cheie implicate în fermentația lactatului se corelează slab cu fenotipurile lactobacilelor (Tabelul 7). Cu toate acestea, s-a demonstrat că, în anumite condiții, lactobacilele pot comuta între producția unică de acid lactic și producția de produse finale mixte, inclusiv acid acetic, acid lactic, etanol și CO2 (46, 47).

Potențialul metabolic al Lactobacillales este completat de capacitățile sale de transport prezise. În special, sistemele de absorbție a aminoacizilor domină asupra sistemelor de absorbție a zahărului și a peptidelor. Dintre sistemele detectate de absorbție a zahărului, cele specifice pentru oligozaharide și glicozide sunt mai mari decât cele pentru zaharurile libere. În plus, Lactobacillales codifică o varietate de pompe de eflux de droguri, peptide și macromoleculare prevăzute, dintre care unele pot fi implicate în semnalizarea intercelulară.

Alte capacități metabolice ale lactobacilelor sunt enumerate în Tabelul 8, care este publicat ca informații de sprijin pe site-ul web PNAS. În general, Lb. brevis, Lb. johnsonii, Lb. gasseri, Lb. delbrueckii și P. pentosaceus au repertorii extrem de înguste ale căilor biosintetice, în timp ce Lc. lactis ssp. lactis, Lc. lactis ssp. cremoris, Lb. plantarum și Le. mezenteroidele păstrează un repertoriu biosintetic mult mai larg.

Bacteriocinele.

Concluzii finale.

Analiza comparativă genomică descrisă aici sugerează, de asemenea, o revizuire a taxonomiei Lactobacillales. Analiza filogenetică a mai multor secvențe de proteine ​​a arătat că ramura streptococilor - lactococilor este bazală în arborele Lactobacillales și că grupul Pediococcus este o soră a grupului Leuconostoc, care susține parafilia genului Lactobacillus. Mai mult, Lb. casei este plasat cu încredere la baza Lb. grupul delbrueckii, care contrazice clasificarea anterioară.

Materiale și metode

Secvențierea puștilor cu genom întreg a fost efectuată în S.U.A. Departamentul Energiei Institutul Comun al Genomului. Genomii au fost secvențați la adâncimea de ~ 8 × și s-au asamblat folosind Jazz, ansamblorul Joint Genome Institute (51). Închiderea decalajului a fost efectuată la Fidelity Systems, Inc., utilizând secvențierea genomică directă (52).

ORF-urile au fost identificate cu programul GeneMarkS (53). Funcțiile genei au fost prezise prin atribuirea genelor prevăzute COG-urilor (www.ncbi.nlm.nih.gov/COG) prin utilizarea metodei COGNITOR (24) și prin căutări în baze de date efectuate cu programul PSI-BLAST (54). ARN-urile de transfer au fost prezise cu programul tRNAscan-SE (55). LaCOGs au fost construite utilizând proceduri descrise anterior (23, 56). Analiza filogenetică a fost efectuată utilizând metodele cu cel mai mic pătrat sau cu maximă probabilitate, iar scenariile de câștig/pierdere a genei au fost reconstruite cu o versiune a algoritmului de parsimonie ponderată (29).

Detalii metodologice suplimentare și o listă detaliată a numerelor de depunere a datelor sunt furnizate în Materiale și metode de sprijin, care este publicat ca informații de sprijin pe site-ul web PNAS.

Mulțumiri

Note de subsol

  • ↵ d Cui îi poate fi adresată corespondența. E-mail: kooninncbi.nlm.nih.gov, trkunity.ncsu.edu, bcweimercc.usu.edu sau damillsucdavis.edu