Departamentul de Științe Biomedice, Centrul de Rezonanță Magnetică Nucleară, Facultatea de Științe ale Sănătății;

Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: W. Jørgensen, Dept. de științe biomedicale, Centrul RMN, Univ. din Copenhaga, Facultatea de Sănătate, Blegdamsvej 3, 2200 Copenhaga, Danemarca (e-mail: [email protected]).

Departamentul de Științe Biomedice, Centrul de Rezonanță Magnetică Nucleară, Facultatea de Științe ale Sănătății;

Departamentul de Științe de bază animale și veterinare, Facultatea de Științe ale Vieții; și

Departamentul de Științe de bază animale și veterinare, Facultatea de Științe ale Vieții; și

Departamentul de Științe Biomedice, Centrul de Rezonanță Magnetică Nucleară, Facultatea de Științe ale Sănătății;

Departamentul de Științe Biomedice, Centrul de Rezonanță Magnetică Nucleară, Facultatea de Științe ale Sănătății;

Departamentul de Științe Biomedice, Centrul de Rezonanță Magnetică Nucleară, Facultatea de Științe ale Sănătății;

Institutul de Medicină Sportivă, Spitalul Bispebjerg și Centrul pentru Îmbătrânirea Sănătoasă, Facultatea de Științe ale Sănătății, Universitatea din Copenhaga, Copenhaga, Danemarca

Departamentul de Științe Biomedice, Centrul de Rezonanță Magnetică Nucleară, Facultatea de Științe ale Sănătății;

Abstract

Într-un model de oaie, am investigat efectele dietei asupra mitocondriilor mușchilor scheletici pentru a căuta programarea fetală. În timpul sarcinii, oile au fost hrănite în mod normal (N) sau au fost restricționate cu 50% din alimentele (L) în ultimul trimestru, iar mieii născuți de aceste oi au primit o dietă normală (N) sau bogată în grăsimi (H) în primele 6 luni de viață. Am examinat funcția mitocondrială în fibrele musculare permeabilizate de la miei la vârsta de 6 luni (adolescență) și după vârsta de 24 de luni (maturitate). Dieta H postpartum pentru miei a indus o creștere de ± 30% (P o 2max și o creștere de ~ 50% (P o 2max (∼40%, P o 2max la vârsta adultă, rezultă din subnutriția gestațională. Dieta postnatală bogată în grăsimi are ca rezultat o creștere pronunțată a RCR și a V o o 2max în adolescență. Cu toate acestea, aceste efecte sunt reversibile prin corectarea dietei și nu sunt menținute la vârsta adultă.

În lucrarea de față, am testat ipoteza că nutriția calorică gestațională insuficientă combinată cu expunerea precoce postnatală la hipernutriție duce la disfuncții mitocondriale în mușchiul scheletic. Mai exact, am testat dacă aceste condiții nutriționale adverse la începutul vieții ar fi 1) crește cuplarea respiratorie a producției de energie mitocondrială, 2) scad expresia proteinei de decuplare mitocondriale, 3) micșorați consumul de oxigen al stării 4 sau 4) scade absorbția maximă de oxigen mitocondrială (V ‡ o 2max) și 5) dacă expresia fenotipică a acestor evenimente de programare ar depinde de vârstă.

Produse chimice și soluții

Reactivi.

Dacă nu se specifică altfel, reactivii au fost cumpărați de la Sigma-Aldrich și au fost de calitate analitică sau mai bună.

Medii de incubație pentru experimentele mitocondriale.

Două medii diferite au fost utilizate în experimente: 1) mediu de relaxare conținând 10 mM etilen glicol-bis (β-aminoetil eter)-N,N,N′,NAcid ′ -tetraacetic (EGTA), 2,77 mM CaCl2 (liber [Ca 2+] ∼100 nM), 6,56 mM MgCl2, 0,5 mM ditiotreitol (DTT), 50 mM 2- (N-acid morfolino) etansulfonic (MES) hidrat, 20 mM imidazol, 20 mM taurină, 5,3 mM Na2ATP și 15 mM PCr, adăugând KOH ~ 90 mM pentru un pH de 7,1 și 2) mediu oxigraf care conține 10 mM EGTA, 2,77 mM CaCl2 (gratuit [Ca 2+] ∼100 nM), 1,74 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mM MES hidrat, 20 mM imidazol, 20 mM taurină și 2 mg/ml bovin albumina serică, adăugând KOH ∼132 mM la un pH de 7,1 (50).

Animale

Douăzeci de ovine Shropshire multipare, însărcinate cu două gemeni, au fost utilizate în experimente, care au fost efectuate la instalația experimentală pentru animale mari, Rørrendegård, Facultatea de Științe ale Vieții, Universitatea din Copenhaga, Copenhaga, Danemarca. Toate procedurile experimentale au fost aprobate de Comitetul Național pentru Experimentarea Animalelor (Danemarca). În ultimele 6 săptămâni de gestație (ultimul trimestru), oile gemene însărcinate au fost hrănite fie cu o dietă normală (N), unde însilozarea și concentratul de iarbă (Fårekraft T; Lærkegården, Munkebjergby, Danemarca) au fost hrănite pentru a îndeplini cerințele de energie și proteine, sau o dietă restricționată (L) echivalentă cu 50% din cantitatea de siloz și concentrat consumate de grupul N, dar cu compoziție nutritivă neschimbată. Apa și un amestec de vitamine-minerale (Maxcare Sheep Pre Lamb Minerals; Trouw Nutrition International, Putten, Olanda) au fost disponibile în orice moment. În plus, ambelor grupuri li s-a oferit paie de orz în cantități limitate la fiecare hrănire pentru a diminua disconfortul datorat foametei. După naștere, toate oile au fost hrănite ad libitum cu aceeași dietă pentru a asigura o producție suficientă de colostru până la 3 zile după naștere, când au fost scoase din miei lor.

De la 3 zile la 6 luni postpartum, mieii au fost repartizați la fiecare dintre regimurile lor de hrănire postnatală. Hrănirea postnatală a fost fie o dietă normală (N), fie bogată în grăsimi (H). În perioada de lapte (de la 3 zile la 8 săptămâni), mieii din dieta N au primit înlocuitor de lapte (24% proteine, 19% grăsimi și 200 g înlocuitor de lapte/l apă; Friska Sød, DLG) într-o găleată de alăptare de doua ori pe zi. De la vârsta de 2 săptămâni li s-a oferit fân verde uscat artificial (Tjørnehøj Mølle, Hedehusene, Danemarca). După înțărcare (8 săptămâni până la 6 luni), mieilor li s-a oferit numai fân verde uscat. Mielii din dieta H au primit smântână (38% grăsimi, 2,1% proteine, 3,2% carbohidrați) în loc de lapte până la vârsta de 6 luni. Pe tot parcursul experimentului, cantitățile de lapte și fân au fost ajustate săptămânal pentru a menține creșterea în greutate vie la oile individuale la aproximativ 250 g/zi. După 6 luni, jumătate din miei au fost eutanasiați (furnizând cele 4 grupe: NN6, NH6, LN6, LH6), iar cealaltă jumătate au fost crescute pe o dietă pe bază de iarbă/fân de la 6 luni până când au fost eutanasiați la 24 lună de vârstă (cu 4 grupuri suplimentare: NN24, NH24, LN24, LH24).

Biopsii musculare

Probele (∼2 g) au fost decupate din bicepsul femural (BF), iar mușchiul flexor halucis longissimus (FHL) al unui picior posterior o 2max a fost luat ca respirație de stat 3 cu efect suplimentar de decuplare FCCP.

Colorarea ATPazei.

Probele de mușchi proaspete au fost montate cu Tissue-Tek și congelate în izopentan răcit cu azot lichid și depozitate la -80 ° C până la secționare. Secțiunile (10 μm) au fost procesate pentru histochimia ATPazei, care a fost efectuată după preincubare la pH de 4,37 și 10,30, pentru a permite diferențierea tipurilor de fibre I (lent, roșu) și II (rapid, alb) (11).

Activitatea conținutului de proteine ​​și a citratei sintazei

Concentrațiile de proteine ​​și activitatea citratului sintază (CS) în biopsii au fost determinate în 10% omogenate preparate în tampon (50 mM Tris · HCI, 0,6 mM MnCl2, 2 mM citrat, 0,1% Triton X-100, pH = 7,4; Ultra Turaxhomogenizer) . Concentrațiile de proteine ​​au fost determinate folosind metoda lui Lowry și colab. (39). Activitatea CS (EC 4.1.3.7) a fost testată la 25 ° C (55).

Activitatea Aconitase

Activitatea aconitazei (EC 4.2.1.3) a fost utilizată ca măsură a formării ROS în mitocondrii (41). Aconitaza a fost testată spectrofotometric la 30 ° C și pH 7,4 (20). Zece la sută omogenizați musculari au fost preparați în tampon stoc de testare (50 mM Tris · HCI, 0,6 mM MnCl2, 2 mM citrat, 0,1% Triton X-100, pH = 7,4). Amestecul de testare a fost preparat proaspăt în ziua respectivă: 0,2 mM NADP, 1 U/ml izocitric dehidrogenază (Sigma lot 073K7073) și 5 mM citrat de sodiu în tampon stoc de testare. Reacția a fost inițiată atunci când s-a adăugat omogenizat la 1.000 pl de amestec de testare.

RT-PCR

Nivelurile de proteine ​​3, PGC-1α și mARN de decuplare au fost evaluate prin RT-PCR în timp real.

ADN mitocondrial.

ADN-ul mitocondrial (ADNmt) a fost măsurat ca raport între ADN-ul mitocondrial și genomic. ADN-ul total a fost izolat folosind reactiv DNAzol (Centrul de Cercetări Moleculare). După protocolul producătorului, ADN-ul a fost precipitat cu etanol și amestecul final de rezoluție a fost diluat de 100 de ori. Cinci microlitri ai acestei diluții au fost amplificați într-o reacție PCR de 25 μl conținând 1 × Quantitect SYBR Green Master Mix (Qiagen, Hilden, Germania) și 100 nM de ambele sensori și antisens. Amplificarea a fost monitorizată utilizând mașina PCR în timp real MX3000P (Stratagene), urmând aceeași configurare termică ca mai sus. Grunduri concepute pentru a viza ST7 pentru ADN genomic (sens CCTGAGCACACATCCACCCAAG, antisens GCCAGGGAGGGACAAAGACAAA) și citocrom C oxidaza-1 pentru ADNmt (sens ATCGGTGGATTCGGCAACTGA, antisens GGAGTAACAGGAAAGATGGGGGAAG) au fost utilizate. Valorile pragului ciclului au fost legate de o curbă standard realizată cu produsele PCR clonate.

Analize statistice

Analiza bidirecțională a varianței (ANOVA) a fost efectuată pe date transformate în jurnal în programul R (R 2.9.0, www.r-project.org) și prezentate în tabele împreună cu datele. Nivelul de semnificație a fost stabilit la P o 2max și RCR

Valorile mitocondriale V o o 2max, date ca respirație FCCP-stare necuplată 3 normalizată la greutatea umedă a țesutului, sunt prezentate în Tabelul 1, iar RCR, date ca raportul de stare 3/stare 4, este prezentat în Tabelul 2. - și grupurile de 24 de luni, V ‡ o 2max a fost mai mare în FHL comparativ cu mușchiul BF (P o creștere de 2max cu 25-80% (P o 2max și RCR observate la 6 luni ca urmare a dietei bogate în grăsimi nu au fost reținute, indicând faptul că reversibilitatea completă este posibilă printr-o dietă normală de la 6 la 24 luni (tabelele 1 și 2).

Tabelul 1. V o o 2max (μmol O2/g greutate umedă) în fibre permeabilizate din mușchii BF și FHL ai mieilor cu vârsta de 6 și 24 de luni

Valorile sunt mijloace ± SD; n = 4-5. V ‡ o 2max, absorbție maximă de oxigen; BF, biceps femoral; FHL, flexor hallucis longissimus; LGD, dietă de gestație târzie; PD, dieta descendenților; LGD × PD, interacțiunea între diete; NS, nu semnificativ. Grupurile de descendență bazate pe maternă [prima literă (N sau L), care se referă la dieta maternă] și PD [a doua literă (N sau H), care se referă la dieta descendenților după naștere] sunt normale-normale (NN), normale -înalt (NH), low-normal (LN) și low-high (LH). Statisticile sunt afișate în coloanele ANOVA cu 2 căi.

Tabelul 2. RCR în fibrele permeabilizate de la mușchii BF și FHL ai mieilor în vârstă de 6 și 24 de luni

Valorile sunt mijloace ± SD; n = 4-5. RCR, raportul de cuplare respiratorie. Datele arată raportul dintre starea 4 și respirația stării 3 decuplate. Statisticile sunt afișate în coloanele ANOVA cu 2 căi.

prin

FIG. 1.Colorarea ATPazei a celor 2 mușchi, biceps femural (A) și flexor hallucis longissimus (B). Ambii mușchi sunt prezentați la pH 10,3 și × 10.

Programarea fetală (efectul restricției de dietă de gestație târzie) nu s-a manifestat la animalele de 6 luni (adolescență), în timp ce la vârsta de 2 ani (vârsta adultă) programarea fetală a putut fi observată ca o scădere de 15-20% a V ™ o 2max (P = 0,05; Tabelul 1) și o scădere a RCR (P o 2max a fost observată la 24 de luni comparativ cu vârsta de 6 luni (P

Tabelul 3. Respirația 4 (μmol O2 min/g în greutate umedă) în fibrele permeabilizate din mușchii BF și FHL ai mieilor cu vârsta de 6 și 24 de luni

Valorile sunt mijloace ± SD; n = 4-5. Statisticile sunt afișate în coloanele ANOVA cu 2 căi.

* Diferență semnificativă între grupurile NH și LH.

UCP3, PGC-1α și PPARδ mARN

A fost o creștere de aproximativ trei ori mai mare (P

FIG. 2.Decuplarea nivelurilor de proteine ​​3 mARN la mușchiul biceps femoral (BF) și flexor halucis lung (FHL) la miei cu vârsta de 6 și 24 de luni. Statisticile sunt prezentate în tabelele ANOVA bidirecționale (fund). Dieta de gestație târzie (LGD), dieta descendenților (PD) și interacțiunea (LGD × PD). *P


FIG. 3.Receptor activat cu proliferator peroxsom (PPAR) γ niveluri de ARNm coactivator-1α în BF și FHL la miei în vârstă de 6 și 24 de luni. Statisticile sunt prezentate în tabelele ANOVA cu 2 căi (fund).


FIG. 4.Niveluri de mARN de PPARδ în BF și FHL la miei în vârstă de 6 și 24 de luni. Statisticile sunt prezentate în tabelele ANOVA bidirecționale (fund).

CS, mtDNA și ROS

Activitatea CS a fost crescută prin dieta bogată în grăsimi la vârsta de 6 luni în mușchiul FHL (P

Tabelul 4. Activitate citrat sintază (U/g țesut umed în greutate) în mușchii BF și FHL ai mieilor în vârstă de 6 și 24 de luni

Valorile sunt mijloace ± SD; n = 4-5. Statisticile sunt afișate în coloanele ANOVA cu 2 căi.

Tabelul 5. ADNmt/ADNm în mușchii BF și FHL ai mieilor în vârstă de 6 și 24 de luni

Valorile sunt mijloace ± SD; n = 4-5. ADNmt, ADN mitocondrial; ADNc, ADN nuclear. Statisticile sunt afișate în coloanele ANOVA cu 2 căi.

FIG. 5.Nivelurile de activitate ale aconitazei la BF și FHL la mieii în vârstă de 6 și 24 de luni. Statisticile sunt prezentate în tabelele ANOVA bidirecționale (fund). *P

Constatările cheie ale prezentului studiu au fost că mitocondriile musculaturii scheletice ale descendenților sunt afectate atât de subnutriție în timpul gestației târzii, cât și de o dietă bogată în grăsimi la începutul vieții postnatale, dar calendarul acestor efecte nutriționale diferă. Astfel, subnutriția maternă în timpul celui de-al treilea trimestru programează o reducere a V ™ o 2max mitocondrială în viața adultă, așa cum se observă la oile în vârstă de 24 de luni, dar nu și la animalele adolescente (6 luni). Dieta postnatală bogată în grăsimi, pe de altă parte, induce o creștere pronunțată a RCR și a Vma o 2max, efecte care au fost reversibile prin expunerea la o dietă normală de la 6 luni la 2 ani.

Restricția hranei pentru gestația târzie maternă

Deși este bine stabilit că mediul intrauterin poate afecta metabolismul descendenților pe o scară de viață, nu este clar dacă este necesar un anumit fundal genetic pentru a promova o astfel de programare fenotipică. Cu toate acestea, se poate observa că datele recente la șoareci sugerează că tendința de a dezvolta obezitate și toleranța la glucoză afectată rezultată din programarea fetală a descendenților din prima generație este transmisă descendenților din a doua generație, în ciuda circumstanțelor normale de gestație (30). În mod similar, un studiu la șobolani arată că toleranța afectată a glucozei poate fi transmisă pe parcursul a trei generații (6, 7, 24). Aceste studii sugerează că informațiile epigenetice pot fi transmise de-a lungul generațiilor.

Dieta bogată în grăsimi postnatală

O altă posibilitate este ca UCP3 să fie activat mai târziu în timpul gestației sau la naștere și că subnutriția maternă din ultimul trimestru ar fi putut împiedica această activare (12).

Mărimea RCR este influențată în mod evident atât de frecvențele respiratorii de starea 4, cât și de starea 3. În contextul prezentului studiu, este de un interes deosebit faptul că cu cât este mai mare raportul de cuplare, cu atât poate fi mai mare formarea ROS mitocondrială (1, 46) și potențial cu atât este mai mare riscul de deteriorare permanentă a mitocondriilor și a altor organite sau căi din celula musculară. Cu toate acestea, faptul că capacitatea mitocondrială pentru sinteza ATP in vivo nu este afectată în mod semnificativ la subiecții umani adulți cu greutate redusă la naștere, astfel cum a fost evaluat de 31 P-MRS, sugerează că afectarea mitocondrială nu poate fi pasul inițial către un fenotip diabetic (10). Luând activitatea aconitazei ca măsurare a formării ROS (41), datele noastre sugerează scăderea formării mai mult decât creșterea ROS (Fig. 5), pentru care noi în prezent nu avem nicio explicație.

Rezultatele noastre (Tabelul 1) arată că aportul unei diete bogate în grăsimi la începutul vieții determină o creștere semnificativă (30-80%) a respirației mitocondriale. Acest lucru este în concordanță cu mai multe studii anterioare asupra mitocondriilor izolate de la șobolani (26-28). Cu toate acestea, atunci când este normalizată la cantitatea de ADNmt, această creștere a consumului de oxigen nu mai este semnificativă, sugerând că creșterea este cauzată în întregime de o cantitate crescută și nu de o schimbare calitativă a mitocondriilor.

Un studiu de timp, de asemenea la șobolani, a arătat că creșterea consumului de oxigen ca răspuns la hrana bogată în grăsimi implică o creștere inițială urmată de o reglare descendentă vizibilă după 40 de zile (15). Cu toate acestea, în studiul de față avem un singur punct de timp cu dieta bogată în grăsimi, 6 luni. Acest punct de timp pare să corespundă cu 40-60 de zile la șobolani (șobolanii au vârsta ≤3 ani și oile ∼9 ani). Astfel, efectul tranzitoriu al unei diete bogate în grăsimi asupra consumului de oxigen raportat la șobolani (15) nu pare să apară în același interval de timp la oi. Cu toate acestea, am observat că, la 1,5 ani după întreruperea dietei bogate în grăsimi (punctul de timp de 24 de luni), capacitatea respiratorie crescută nu mai era prezentă (Tabelul 1).

Dieta bogată în grăsimi a indus o scădere a nivelurilor de ARNm PGC-1α (Fig. 3). Un posibil mecanism pentru aceasta ar putea fi hipermetilarea regiunii promotorului PGC-1α cauzată de acizii grași liberi, așa cum sugerează un studiu recent (3).

Considerații metodologice