Microbiologie alimentară

Editat de
Javier Carballo

Universitatea din Vigo, Spania

Revizuite de
Maria D. Serradell

Consiliul Național pentru Investiții și Investiții Tehnice (CONICET), Argentina

Jinshui Zheng

Universitatea Agricolă Huazhong, China

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

soia

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • Laborator cheie de prelucrare a cărnii și control al calității, MOE, Laborator cheie de prelucrare a cărnii, MOA, Centrul de inovare colaborativă Jiangsu pentru producția, procesarea și controlul calității cărnii, Universitatea agricolă din Nanjing, Nanjing, China

Introducere

În ultimii ani, s-a sugerat că aportul excesiv de carne și produse din carne este asociat cu unele tulburări metabolice (Tilman și Clark, 2014). Mai precis, compușii N-nitro și aminele heterociclice, care s-au format în timpul gătirii cărnii roșii la temperaturi ridicate, ar putea fi factori critici pentru un risc crescut de mortalitate prin cancer colorectal (Pan și colab., 2012; Bastide și colab., 2015) . Cu toate acestea, este faptul că carnea are multe funcții biologice în ceea ce privește nutrienții foarte biodisponibili, inclusiv aminoacizii esențiali, fierul hemic și vitaminele (Pereira și Vicente, 2013).

Alimentația este un factor major care poate modela microbiota intestinală (Subramanian și colab., 2014). S-a demonstrat că tractul gastro-intestinal și bacteriile rezidente joacă un rol crucial în extragerea și metabolizarea ingredientelor dietetice (Muegge și colab., 2011; Tyakht și colab., 2012; Tang și colab., 2013). Există aproximativ 12-18 g de proteine ​​care intră în colonul uman în fiecare zi, constând din proteine ​​dietetice reziduale și enzime endogene secretate în intestinul subțire (Scott și colab., 2013). Aproximativ 10% din proteinele ingerate pot ajunge la colon, care depinde de tipul și cantitatea de proteine ​​consumate (Cummings, 1997). Proteinele dietetice reziduale și enzimele endogene sunt principala sursă de azot pentru creșterea microbiotei intestinale (Cummings și MacFarlane, 1991). Aminoacizii ar deveni o sursă de energie în colonul distal (Hamer și colab., 2012). Studii recente au indicat că metaboliții derivați din microbiota intestinală pot avea un anumit impact asupra sănătății gazdei, de exemplu, acizii grași cu lanț scurt, în special butiratul, pot fi serviți ca energie pentru țesuturile gazdei (Flint și colab., 2015). Pe de altă parte, lipopolizaharida (LPS), o endotoxină, poate intra în circulație și poate fi legată de proteina de legare a lipopolizaharidelor (LBP) în ficat (Weiss, 2003; Zhao, 2013). Complexul LPS-LBP se leagă în continuare de receptorul CD14, care mediază activarea macrofagelor pentru a produce citokine inflamatorii (Lukkari și colab., 1999).

Materiale și metode

Animale și eșantioane

Șobolani Sprague-Dawley masculi de patru săptămâni (117 ± 10 g) au fost achiziționați de la Zhejiang Experimental Animal Center (Zhejiang, China, SCXK9 2008-00) și adăpostiți într-un centru specific pentru animale fără patogeni (SYXK 2011-0037) . După 7 zile de aclimatizare (sursă de proteine: cazeină), șobolanii au fost repartizați aleatoriu la patru diete formulate cu cazeină și proteine ​​din carne de vită, pui și soia (n = 8 fiecare grup). Caseina este singura proteină din dietele standard de șobolani recomandate de Institutul American de Nutriție și, prin urmare, stabilim grupa cazeinei ca martor. Dietele formulate au fost preparate așa cum s-a descris anterior (Zhu și colab., 2015). Animalele au fost întreținute individual în cuști ventilate din plastic și li s-a administrat apă și diete ad libitum într-o cameră controlată de temperatură și umiditate (20,0 ± 0,5 ° C, 60 ± 10%) cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Protocolul experimental care implică animale a fost revizuit și aprobat de Comitetul Etic al Centrului Experimental pentru Animale al Universității Agricole din Nanjing. Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare și reglementările relevante ale Comitetului etic al Centrului pentru animale experimentale din Universitatea Agricolă din Nanjing.

După hrănirea de 90 de zile, toți șobolanii au fost sacrificați după 4 ore de post. Conținutul colonic distal a fost colectat și transferat în două tuburi eppendorf, apoi înghețat imediat în azot lichid și depozitat la -80 ° C pentru analize metabolomice și microbiote.

Microbiotă și analiză metabolomică

Analiza microbiotei a fost trimisă la studiul nostru anterior (Zhu și colab., 2015). Pe scurt, conținutul de cecal a fost colectat, înghețat în azot lichid și depozitat la -80 ° C înainte de a fi analizat. ADN-ul a fost extras din fiecare probă folosind QIAamp DNA Stool Mini Kit (Nr. 51504, Qiagen, Germania) conform protocolului producătorului. Gena ARN ribozomal 16S (ARNr) din conținutul cecal a fost amplificată cu primeri universali: F515 (5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3 ') și R907 (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'). Regiunea hipervariabilă V4-V5 care este universală pentru aproape toți taxonii bacterieni a fost aplicată pentru amplificare. Ampliconii purificați au fost secvențați pe platforma MiSeq (Illumina, San Diego, California, SUA) conform protocoalelor standard dintr-o companie comercială (Shanghai Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd, Shanghai, China).

Analiza mRNA bazată pe reacția în lanț a transcriptazei-polimerazei (RT-PCR)

O analiză semicantitativă RT-PCR a fost utilizată pentru a estima nivelurile de ARNm de LBP și CD14 în probele de ficat. ARN-ul total a fost izolat din probe de ficat folosind TaKaRa MiniBEST Kit de extracție a ARN-ului universal (TaKaRa, Japonia) conform protocolului producătorului. ARN-ul total a fost cuantificat printr-un spectrofotometru NanoDrop ND-2000 (NanoDrop Technologies, Delaware, SUA) la 260/230 și 260/280 nm. Apoi 400 ng ARN a fost transcris invers în 10 μL ADNc folosind PrimeScript ™ RT Master Mix (TaKaRa, Japonia) și Peltier Thermal Cycler 200 (MJ Research, Watertown, MA, SUA). ADNc a fost dizolvat în apă fără RNază și depozitat la -20 ° C.

Reacțiile qRT-PCR în doi pași au fost efectuate în triplicat pe plăci cu 96 de godeuri utilizând un sistem PCR în timp real 7500 (Applied Biosysytems, Foster, CA) cu SYBR® Premix Ex TaqTM (TaKaRa, Ostu, Japonia). LBP (Lukkari și colab., 1999), CD14 (Järveläinen și colab., 1997) și secvențele primer-β-actină au fost sintetizate de Sangon Biotech (Shanghai, China). Aceste secvențe de exemplu au fost enumerate în Tabelul 1. Concentrațiile de șablon și primeri, eficiența și consistența amplificării LBP, CD14 și β-actină au fost evaluate printr-o curbă standard relativă prin diluarea eșalonului (1: 1-1: 625). Soluția de reacție (20 μL) conține 10 μL SYBR ® Premix Ex Taq, 0,4 μL primer primer PCR (10 μM) și 0,4 μL primer de rezervă PCR (10 μM), 0,4 colorant de referință ROX II, 2 μL ADNc și 6,8 μL dH2O. Condițiile de ciclism au fost următoarele: 30 s pentru denaturare la 95 ° C, 40 cicluri de 5 s la 95 ° C și 34 s la 60 ° C pentru denaturare, urmate de alternanțe triple între 95 și 60 ° C pentru analiza curbei de topire pentru a verifica specificul unei singure amplificări. Modificările ori ale expresiei LBP și CD14 au fost calculate prin metoda 2-Ct normalizată la β-actină, stabilind grupa de proteine ​​din soia ca martor.

tabelul 1. Grunduri utilizate pentru qRT-PCR

Western Blotting

Analize statistice

S-a efectuat o analiză liniară discriminantă (LDA) împreună cu măsurători ale dimensiunii efectului (LEfSe) (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/) pentru a descoperi bacterii intestinale de înaltă dimensiune și a caracteriza diferențele dintre două sau mai multe condiții biologice ( sau clase; Segata și colab., 2011; Zhu și colab., 2015). Diferitele caracteristici au fost identificate la nivelurile OTU și gen.

Analizele multivariate au fost efectuate cu software-ul SIMCA-P (versiunea 11.5) pentru a discrimina metaboliții în conținutul colonic. Analiza componentelor principale (PCA) și analiza discriminantă a celor mai mici pătrate (PLS-DA) au fost efectuate pe datele RMN. Modelele PLS-DA au fost aplicate cu o validare încrucișată de cinci ori și evaluate cu valorile R 2 X și Q 2. Modelele au fost validate în continuare cu un test de permutare (200 permutări). În modelul de proiecție ortogonală către structura latentă (OPLS), matricea X reprezintă concentrația tuturor metaboliților din fiecare probă, iar matricea Y reprezintă informațiile de grup ale fiecărei probe. Poate filtra zgomotul din date și distinge diferența dintre două grupuri (Trygg și Wold, 2003), astfel încât a fost preformat pentru a maximiza separarea între două grupuri. Metaboliții au fost diferențiați pe baza importanței variabile în scorurile de proiecție (VIP) cu mai mult de 1 și modificări semnificative statistict-Test, P Spectrometrie 1 H RMN (tabelul suplimentar 1), incluzând 22 de aminoacizi, 7 acizi grași cu lanț scurt, 8 zaharuri, 4 acizi fenolici, 4 amine, 2 alcooli, 2 derivați de aminoacizi, 2 cetone, 5 componente ale acidului nucleic, alte 9 organice acizi, 1 vitamină/cofactor și colină.

Analiza componentelor de principiu a relevat variații mari între și intra-grup ale metaboliților (Figura 1). Grupul de proteine ​​de pui a fost bine separat de cazeină, carne de vită și grupe de proteine ​​din soia, indicând faptul că metaboliții colonici au prezentat răspunsuri diferite la proteinele de pui din dietă (P Datele spectrale 1 H RMN au fost utilizate ca matrice X și informațiile de clasificare au fost utilizate ca matrice Y falsă. Graficul OPLS a arătat că profilul general al metaboliților polari colonici diferă semnificativ (Figura 3). Variabilele responsabile cu cele mai bune 15 scoruri VIP între cazeină și celelalte trei grupe de proteine ​​au fost prezentate în Figura 3. Comparativ cu grupa de cazeină, grupul de proteine ​​din carnea de vită avea niveluri mai mici de glucoză, riboză, galactoză, butirat, propionat, uracil, alanină, dar concentrații mai mari de succinat și lactat. Grupul de proteine ​​de pui avea lactat mai mare, dar galactoză, uracil, butirat, riboză, propionat și glucoză mai scăzute. Grupul cu proteine ​​din soia avea succinat, glucoză, propionat, lactat și butirat mai ridicat, dar leucina mai scăzută, xantină, valină, uracil, riboză, glutamat și alanină.

Figura 3. Comparații în perechi între conținutul de colon extrag spectre obținute din grupele de carne de vită, pui și soia utilizând analiza OPLS. Fiecare figură are două părți: partea din stânga este graficul scorului OPLS, partea dreaptă este primele 15 scoruri VIP. (A) grupa de proteine ​​din carnea de vită vs. grup de cazeină; (B) grupa de proteine ​​din soia vs. grup de cazeină; (C) grupa de proteine ​​de pui vs. grupa cazeinei.

Microbiota intestinală a avut un răspuns distinct la proteinele dietetice

Informatii generale

Cele 32 de probe de colon au avut un total de 998.150 citiri brute utilizabile cu o medie de 31.192 ± 4.955 lecturi fiecare (Figura suplimentară 1A). Citirile au fost delimitate în 837 unități de taxonomie operațională (OTU) cu o medie de 380 ± 70 pe probă la un nivel de similaritate de 97% (Figura suplimentară 1B). Nu a fost observată nicio diferență semnificativă în citirile dintre oricare două grupuri de dietă (p > 0,05), dar grupul de proteine ​​din carne de vită a avut un număr mai mare de OTU decât grupele de cazeină și proteine ​​de pui (p 0,05, Tabelul suplimentar 2) dintre patru grupuri din ACE, Chao, Shannon, Simpson și indicii de acoperire Good pentru microbiota intestinală.

Efectul dietei

Analiza componentelor de principiu a relevat diferențe semnificative semnificative în bacteriile colonice între grupurile de dietă (Figura 4). Grupa de proteine ​​de pui a fost bine separată de grupurile de cazeină, carne de vită și soia din PC 1, în timp ce grupele de proteine ​​de pui și carne de vită au fost separate de grupele de cazeină și proteine ​​de soia în PC 2. Rezultatele indică faptul că bacteriile intestinale au prezentat răspunsuri la proteinele de pui din dietă, de la cele la cazeină, proteine ​​din carne de vită și proteine ​​din soia. Grupurile de proteine ​​din soia și cazeină au prezentat o mare asemănare. La nivel de filum (Figura 5), Firmicute și Bacteroidete au fost cele mai predominante două filuri pentru cele patru grupuri, contribuind la 83,5, 75,5, 85,6 și 81,2% din variații pentru cazeina, carnea de vită, puiul și respectiv grupele de proteine ​​din soia. Grupul de proteine ​​de pui a avut cea mai mare abundență de Bacteroidete, dar cea mai mică abundență de Firmicute. Analiza grupării bacteriilor intestinale la nivelul filului a arătat că microbiota intestinală din grupele de carne de vită, cazeină și proteine ​​din soia ar putea fi clasificate în aceeași subclasă separată de cele din grupul de proteine ​​de pui.

Figura 4. PCA punctează graficul microbiotei intestinale a șobolanilor ca răspuns la diferite proteine ​​dietetice. Fiecare punct reprezintă o probă biologică.

Figura 5. Abundența relativă a microbiotei intestinale la nivelul filumului. Graficul circular a arătat compoziția microbiotei intestinale la nivelul filului. Analiza grupării arată că microbiota intestinală din grupa de proteine ​​din carne de vită și soia ar putea fi clasificată în aceeași subclasă și separată de grupa de proteine ​​de pui.

Analiza LeFSe a fost efectuată la nivelul OTU pentru a identifica bacterii specifice pentru diferite grupuri de dietă. Comparativ cu grupul de cazeină, au existat 96 OTU diferențiale (Figura 6). Dintre aceste OTU, 16, 12 și 40 OTU au fost mai mari la grupele de carne de vită, pui și proteine ​​din soia, respectiv, 15, 32 și 18 OTU au fost mai mici în cele trei grupuri de mai sus. În special, grupul de proteine ​​de pui a avut cea mai mare abundență relativă de OTU pentru gen Lactobacillus (OTU427 și OTU746), în timp ce grupul de proteine ​​din soia a avut cea mai mare abundență relativă de OTU pentru familie Ruminococcaceae.

Figura 6. Bacteriile intestinale la nivelul OTU ca răspuns la proteinele dietetice folosind LefSe. (1) Partea din stânga enumeră diferențe semnificative de OTU și filele, familiile și genurile corespunzătoare; (2) Harta de căldură din mijloc arată grupul bogat și grupul sărac din fiecare OTU; (3) Harta de căldură potrivită arată abundența relativă a OTU (log 10 transformat). Fiecare coloană reprezintă un eșantion biologic și fiecare rând reprezintă un OTU.

Proteinele dietetice afectează nivelul endotoxinelor derivate din intestin în ficat

LPS, endotoxinele derivate din intestin, se pot lega de LBP în ficat și pot activa celulele Kupffer prin intermediul receptorului CD14. Citokinele pro-inflamatorii sunt eliberate și acest lucru este postulat pentru a promova leziunile hepatice.

Nu s-a găsit nicio diferență semnificativă în nivelul ARNm LBP în rândul grupurilor dietetice (P > 0,05, Figura 7A). Cu toate acestea, nivelurile de ARNm CD14 s-au dovedit a fi semnificativ mai mici în grupele de cazeină, carne de vită și pui decât grupa de proteine ​​din soia (P 0,05, Figura 8).

Figura 7. Nivelurile de expresie genică ale LBP (A) și CD14 (B) în ficat. Toate datele de cuantificare ARNm au fost normalizate la gena de menaj β-actină. Nivelurile de expresie genică au fost exprimate ca valori în raport cu grupa de proteine ​​din soia. Mijloacele cu diferite indicatoare au diferit semnificativ (P grupa proteine ​​din soia> grupa proteine ​​din carnea de vită (Xuebin Shi, comunicare personală). Acest rezultat a arătat că proteina de pui poate fi mai ușor de digerat și absorbit în intestinul subțire decât proteinele din soia și carnea de vită, care au determinat pătrunderea a puțini aminoacizi în intestinul gros (Christensen, 1984). În al treilea rând, activitatea de absorbție a epiteliului intestinal ar putea avea un impact asupra nivelurilor de aminoacizi (Zhao și colab., 2011). Prin urmare, proteinele din carnea de vită și soia ar putea fi mai puțin digerate și absorbite în intestinul subțire și pot modifica compoziția bacteriilor intestinale din intestinul gros, ceea ce duce la niveluri mai ridicate de aminoacizi în conținutul de colon. Mecanismul de bază necesită investigații suplimentare.

Figura 2 suplimentară. Expresia glutationului S-transferaze în ficat.

Figura suplimentară 3. Raportul F/B al șobolanilor hrăniți cu diferite tipuri de proteine ​​dietetice. a, b, Mijloacele cu litere diferite diferă semnificativ (P Cuvinte cheie: RMN, microbiota intestinală, carne roșie, carne albă, metaboliți

Citare: Zhu Y, Shi X, Lin X, Ye K, Xu X, Li C și Zhou G (2017) Proteinele de vită, pui și soia din diete induc diferite microbiote intestinale și metaboliți la șobolani. Față. Microbiol. 8: 1395. doi: 10.3389/fmicb.2017.01395

Primit: 20 martie 2017; Acceptat: 10 iulie 2017;
Publicat: 27 iulie 2017.

Javier Carballo, Universitatea din Vigo, Spania

Maria de los Angeles Serradell, Centro Científico Tecnológico CONICET La Plata și Universidad Nacional Arturo Jauretche, Argentina
Jinshui Zheng, Universitatea Agricolă Huazhong, China