Microbiom în sănătate și boală

Editat de
Jorge Frias-Lopez

Universitatea din Florida, Statele Unite

Revizuite de
Daniel C. Profet

Universitatea din Texas Southwestern Medical Center, Statele Unite

Abigail Johnson

University of Minnesota Twin Cities, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

frontierele

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Medical Service, New Mexico VA Health Care System, Albuquerque, NM, Statele Unite
  • 2 Departamentul de biologie integrativă, Universitatea din California, Berkeley, Berkeley, CA, Statele Unite
  • 3 Mind Research Network, Universitatea din New Mexico, Albuquerque, NM, Statele Unite
  • 4 Divizia de Gastroenterologie și Hepatologie, Universitatea din New Mexico, Albuquerque, NM, Statele Unite

Introducere

În timpul transplantului de microbiote fecale (FMT), o populație mare de particule asemănătoare virusului (VLP) sunt transferate în tractul gastro-intestinal al destinatarului. Există o populație estimată de 10 9 VLP per gram de fecale, o densitate a populației egală cu cea a bacteriilor fecale (Kim și colab., 2011). Bacteriofagii (fagii) alcătuiesc

90% din VLP într-un virom intestinal sănătos (Reyes și colab., 2012) și s-a observat că modulează compoziția, structura și funcția comunităților microbiene intestinale (Abeles și Pride, 2014; Kim și Bae, 2016; Bao și colab. ., 2018; Hsu și colab., 2018; Moreno-Gallego și colab., 2019). Comunitatea de fagi intestinali a fost, de asemenea, asociată cu „disbioză” microbiană (denumită aici o stare de microbiom asociată în mod semnificativ cu scăderea stării de sănătate) în tulburări precum boala Crohn, colita ulcerativă și cancerul colorectal (Pérez-Brocal și colab., 2013; Wagner și colab., 2013; Norman și colab., 2015). Nu se cunoaște dacă fagii au un rol direct în provocarea sau prevenirea disbiozei, dar posibilitatea este atât o preocupare importantă în ceea ce privește tratamentele FMT existente, cât și o implicație promițătoare pentru viitoarele terapii care vizează microbiomii.

Exagerarea bacteriilor intestinale subțiri (SIBO) este o formă de disbioză caracterizată prin colonizarea crescută a mucoasei intestinului subțire de către bacteriile rezidente (Lin, 2004). SIBO poate fi indus de o varietate de perturbatori ai intestinului, inclusiv o dietă bogată în grăsimi (HFD) (Tomas și colab., 2016) și este tratată în mod obișnuit cu antibioterapie. Această abordare nu este întotdeauna eficientă și recurența SIBO este obișnuită (Lauritano și colab., 2008; Pimentel și colab., 2009). Terapia cu fagi este o opțiune alternativă de tratament antibacterian care nu a fost încă investigată pentru SIBO. Din punct de vedere istoric, terapia cu fagi specifică tulpinii a fost utilizată pentru a ucide un agent patogen bacterian vizat la un anumit loc de infecție (Lin și colab., 2017). Nu se știe dacă o populație diversă de fagi, cum ar fi cea reprezentată în fracțiunea VLP fecală, ar putea fi utilizată pentru a reduce colonizarea de către o populație diversă de bacterii rezidente pe o suprafață mare, cum ar fi mucoasa intestinului subțire.

Prezentul studiu este o investigație a impactului VLP fecale derivate de donator asupra microbiomului intestinal al receptorilor în timpul FMT. Șoarecii donatori au fost tratați cu un HFD, iar fecalele lor au fost transplantate fie întregi (FMT), fie procesate pentru a elimina bacteriile (VLP) în intestinul șoarecilor primitori care au fost hrăniți fie cu HFD, fie cu o dietă standard (SD). Mai exact, am testat ipoteza că transplantul unei fracții extrase de VLP fecale poate reduce densitatea bacteriană a mucoasei intestinului subțire prin compararea efectelor acestor două transplanturi (FMT vs. VLP) asupra densității bacteriene asociate mucoasei și a compoziției microbiomului intestinal.

Metode

Animale

Figura 1. (A) Un total de 18 șoareci donatori au fost randomizați în subgrupuri de n = 3, fiecare subgrup (unul prezentat ca reprezentare) a furnizat transplanturi pentru patru șoareci destinatari. Peletele proaspete din fiecare subgrup au fost colectate, combinate și procesate în tratamente: câte una dintre HFD-FMT, HFD-VLP, SD-FMT și SD-VLP. Această schemă de donație a fost reprodusă de șase ori pentru dimensiunile totale ale grupului de destinatari de n = 6. Nu sunt prezentate grupuri suplimentare de șoareci care primesc control PBS, SD-PBS și HFD-PBS. (B) Grupurile HFD au fost tratate cu 30 de zile de HFD, moment în care au fost colectate probe fecale de la donatori. După 30 de zile pe HFD, șoarecii au fost trecuți înapoi la SD timp de 24 de ore înainte de a primi tratamente care au fost administrate o dată pe zi timp de 3 zile consecutive. Șoarecii au fost eutanasiați la 24 de ore după tratamentul final. Grupurile SD au urmat același program, dar au rămas pe un SD pe durata experimentului. (C) Etape de procesare pentru FMT întregi și tratamente VLP fecale extrase: (1) Pelete fecale omogenizate în PBS; (2) Suspensie fecală microbiota fecală întreagă pentru FMT; (3) Fracțiune VLP fecală extrasă, epuizată de bacterii, pentru tratamente VLP; și (4) Suspensia fecală a componentelor subvirale (filtrată la

Pregătirea transplantului de fecale

Transplanturile fecale au fost preparate folosind probe fecale colectate de la un total de 18 șoareci donatori în ziua 30 a tratamentului lor cu HFD. Șoarecii donatori au fost randomizați în subgrupuri de trei (pentru un total de șase subgrupuri); probele combinate din fiecare subgrup au furnizat transplanturi pentru patru șoareci destinatari: câte unul din SD-FMT, SD-VLP, HFD-FMT și HFD-VLP (Figura 1A). Prin urmare, în fiecare comparație, tratamentul cu VLP a fost derivat din aceleași probe fecale utilizate pentru FMT și fiecare destinatar replicat într-un tratament dat a fost independent din punct de vedere biologic (adică, a primit transplanturi dintr-un subgrup independent). Etapele de procesare au implicat omogenizarea a 1,0 g de probe de fecale proaspete din fiecare subgrup, suspendarea în PBS și separarea în două alicote de volum egal: unul pentru procesare într-un FMT și unul pentru extragerea VLP-urilor (Figura 1C). Pentru tratamentele FMT, suspensia fecală a fost procesată minim folosind doar filtrarea suspensiei fecale prin vată de sticlă pentru a îndepărta particulele mari și resturile. Fracția FMT a fost utilizată atât pentru grupurile de destinatari SD-FMT, cât și pentru HFD-FMT.

Se știe că VLP floculează cu particule în nămol activat (Brown și colab., 2015), prin urmare am început extracția VLP prin agitarea suspensiei fecale folosind margele de zirconiu/silice de 1 mm și un bătător de margele pentru a disloca VLP-urile extracelulare din particulele fecale. Suspensia a fost apoi centrifugată la 5.000 × g timp de 10 minute pentru a forma celule și particule mari. Supernatantul care conține VLP a fost ulterior filtrat printr-un filtru de 0,45 μm pentru a îndepărta bacteriile (Carter, 1996). Filtratul fecal sărăcit de bacterii a fost apoi filtrat în continuare folosind un filtru centrifugal Amicon Ultra-4 100 kDa (Millipore Sigma), care are o dimensiune a porilor suficient de mică pentru a captura toate VLP-urile cunoscute (

3 nm; Bonilla și colab., 2016). VLP-urile de pe filtru au fost spălate de 3 ori cu PBS și apoi resuspendate într-un volum de PBS echivalent cu volumul inițial de suspensie fecală. Fracția VLP fecală extrasă a fost utilizată atât pentru grupurile de destinatari SD-VLP, cât și pentru HFD-VLP. Probele fracției VLP extrase și fluxul din filtrul Amicon 100 kDa au fost examinate utilizând microscopie electronică și citometrie de flux pentru a confirma absența/prezența fagului. Toate PBS utilizate pentru prelucrare au fost filtrate cu o dimensiune a porilor de 0,02 μm pentru a exclude orice bacterie și VLP existente.

Toți șoarecii din grupurile SD-PBS și HFD-PBS au primit o soluție goală PBS filtrată de 0,02-μm ca tratament de control.

Extracția ADN/ARN

Imediat după colectare, secțiuni ale intestinului au fost spălate ușor cu PBS steril pentru a îndepărta conținutul luminal și au fost apoi depozitate la -80 ° C până la analiză. Probele intestinale au fost decongelate și două secțiuni de țesut de 25 mg au fost excizate din ileonul mediu pentru extracția ADN-ului sau a ARN-ului. ADN-ul genomic a fost extras cu trusa DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) și ARN cu RNeasy Mini Kit (Qiagen); ARN a fost transcris invers în ADNc utilizând sistemul de sinteză First-Strand SuperScript III (Invitrogen). ADN-ul microbiomului fecal a fost extras folosind QIAamp DNA Microbiome Kit (Qiagen).

Reacția în lanț cantitativă a polimerazei (qPCR)

Am folosit qPCR pentru a evalua densitatea bacteriană globală a mucoasei intestinului subțire prin cuantificarea copiilor genei universale a ARNr 16s în ADN genomic extras cu perechea de primer Eub338/518. Exemple de perechi pot fi găsite în Tabelul 1. Toate reacțiile au fost completate cu Quantitect SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen). Calculele au fost efectuate cu analiza de analiză CT folosind gena universală rRNA eucariotă 18s pentru standardizare. Toate rezultatele qPCR sunt raportate ca modificări ale pliurilor (medie ± SEM) în raport cu grupul de control SD-PBS.

tabelul 1. Lista exemplelor de perechi utilizate pentru analiza qPCR.

Secvențierea Ampliconului din anii 16

Toate pregătirile și secvențele de bibliotecă au fost efectuate pe bază de taxă de către Centrul de Genomică al Universității din Minnesota (genomics.umn.edu). Probele de ADN genomic extrase din ileon au fost utilizate ca șabloane pentru amplificarea PCR a regiunii V5-V6 a genei ARNr 16s. S-au folosit seturi de grund degenerate care conțin adaptoare Illumina pentru crearea bibliotecii. Secvențele de exemplu, cu porțiunea specifică 16s în aldine, au fost după cum urmează:

Secvențierea și analiza ARNr-ului de 16 ani

Datele brute de secvențiere au fost demultiplexate și controlate de calitate prin aplicarea conductei în DADA2 pentru a genera un număr de secvențe unice. Fiecare secvență a fost tăiată cu lungimea de 260 de perechi de bază pentru direcția înainte și 220 bps pentru direcția inversă pe baza scorului de calitate> 30. Citirile rămase au fost aliniate de instrumentul mafft pentru a construi un copac filogenetic. Rarefacerea citirilor brute a avut loc la 5.000 de secvențe/probă. Un total de 13 șoareci au fost excluși din analiză din cauza abundenței scăzute după rarefacție: unul din HFD-PBS, câte doi din SD-PBS, SD-FMT, SD-VLP și HFD-FMT și patru din HFD-VLP. Măsurile de diversitate alfa (Chao1, Simpson, Shannon și OTU observate) și diversitatea beta (ponderat UniFrac) au fost evaluate pentru toți indivizii rămași din fiecare grup. Toate scripturile de procesare au fost implementate pe o platformă QIIME2 (https://qiime2.org/, versiunea 2017.12).

Citometrie în flux

Probele extrase de VLP fecale au fost analizate cu citometrie în flux pentru a vizualiza VLP-urile extrase. Atât soluția VLP extrasă, cât și fluxul prin filtrul centrifugal Amicon Ultra-4 100 kDa au fost pregătite pentru citometrie în flux conform unui protocol stabilit (Brussaard, 2009). Pe scurt, probele au fost diluate la 1: 1.000 și colorate folosind un stoc comercial de SYBR Green I (concentrație finală de 1: 10.000; ThermoFisher, S7567). VLP-urile fluorescente au fost analizate folosind un citometru de flux Attune NxT (Thermo Scientific) care a fost programat pentru a evalua dispersia laterală și fluorescența la un debit de 12,5 μL/s pentru un total de 2 minute. Rezultatele sunt raportate ca evenimente medii totale (medie ± SEM).

Microscopie electronică cu transmisie (TEM)

Imaginile TEM au fost capturate în instalația de microscopie electronică HSC, susținută de Centrul de Științe ale Sănătății al Universității din New Mexico. Pe scurt, 5-10 μL din fracția fecală extrasă de VLP a fost incubată pe rețele acoperite cu carbon, strălucitoare, timp de 5 minute, rețelele au fost apoi spălate de 3 ori în H2O ultrapur, lichidul în exces a fost eliminat și probele au fost colorate timp de 1 -2 min cu 1% acetat de uranil. Pata în exces a fost eliminată și grilele au fost lăsate să se usuce la aer. Probele au fost examinate într-un Hitachi HT7700 TEM care funcționează la 80 kV; imaginile au fost capturate cu o cameră CCD AMT XR-81.

Analize statistice

Toate analizele statistice au fost efectuate cu consultarea unui statistician. Toate datele qPCR și datele de nivel 16s de filă au fost comparate utilizând analiza ANOVA bidirecțională cu testul lui Grubb pentru a identifica valori aberante. Testarea comparațiilor multiple a fost efectuată folosind corecția Holm-Sidek. Aceste analize statistice au fost efectuate cu GraphPad Prism (Software GraphPad). Ponderile șoarecilor pe parcursul experimentului au fost comparate folosind analiza ANOVA bidirecțională cu măsuri repetate și comparații multiple utilizând corecția Holm-Sidek. Aceste analize au fost efectuate pe SPSS (IBM Corp.). Toate măsurile de diversitate alfa și beta au fost comparate cu Wilcoxon sum-rank și testarea Kruskal-Wallis utilizând MANCOVA permutational cu 999 permutations. Aceste analize statistice au fost efectuate cu platforma QIIME2 (https://qiime2.org/, versiunea 2017.12).

Rezultate

Validarea etapelor de filtrare fecală pentru extragerea fagilor

Analiza imaginilor EM a identificat mai mulți fagi cu morfologie diversă în fracția VLP fecală extrasă (Figura 2). Toți fagii identificabili în mod clar erau cozi, caracteristici ordinii Caudovirales. În această analiză, nu au existat bacterii prezente, confirmând epuizarea bacteriilor prin filtrare. De asemenea, nu a existat VLP ne-fagice identificabile în mod clar, ceea ce este în mod corespunzător dat fiind predominanța cunoscută a fagilor în fracția VLP fecală. Analiza fracțiunii VLP colorate cu I verde de SYBR folosind citometrie în flux a identificat două populații distincte de VLP, care ar putea fi diferențiate pe baza nivelului de fluorescență (Figura 3). Evenimentele totale în 1,5 ml de VLP fecal extras la o diluție de 1: 1.000 au fost semnificativ mai mari decât în ​​fluxul de la unități de filtrare de 100 kDa (8415,7 ± 347,7 și respectiv 167 ± 50,5, p 2 abateri standard de la medie (p 2 abateri standard de la medie (p Cuvinte cheie: bacteriofag, virom intestinal, microbiom intestinal, transplant de microbiota fecală, excrescere bacteriană intestinală mică, disbioză, dietă bogată în grăsimi, terapie microbiană

Citare: Lin DM, Koskella B, Ritz NL, Lin D, Carroll-Portillo A și Lin HC (2019) Transplantarea de particule asemănătoare virusului fecal reduce supraîncărcarea bacteriană a intestinului subțire indusă de grăsimi la șoareci. Față. Celulă. Infecta. Microbiol. 9: 348. doi: 10.3389/fcimb.2019.00348

Primit: 24 mai 2019; Acceptat: 30 septembrie 2019;
Publicat: 15 octombrie 2019.

Jorge Frias-Lopez, Universitatea din Florida, Statele Unite

Abigail Johnson, Universitatea din Minnesota Twin Cities, Statele Unite
Daniel Champlin Profet, UT Southwestern Medical Center, Statele Unite