Xun Zuo

și LifeSensors, Inc., 271 Great Valley Parkway, Malvern, PA 19355, SUA

utilizând

Michael R. Mattern

și LifeSensors, Inc., 271 Great Valley Parkway, Malvern, PA 19355, SUA

Robin Tan

b Departamentul de Științe Biologice, Universitatea Națională din Singapore, 10 Kent Ridge Crescent, Singapore 119260, Singapore

Shuisen Li

c Universitatea Drexel, Școala de Inginerie BioMedicală, 3141 Chestnut Street, Philadelphia, PA 19104, SUA

John Hall

și LifeSensors, Inc., 271 Great Valley Parkway, Malvern, PA 19355, SUA

David E. Sterner

și LifeSensors, Inc., 271 Great Valley Parkway, Malvern, PA 19355, SUA

Joshua Shoo

b Departamentul de Științe Biologice, Universitatea Națională din Singapore, 10 Kent Ridge Crescent, Singapore 119260, Singapore

Hiep Tran

și LifeSensors, Inc., 271 Great Valley Parkway, Malvern, PA 19355, SUA

Peter Lim

b Departamentul de Științe Biologice, Universitatea Națională din Singapore, 10 Kent Ridge Crescent, Singapore 119260, Singapore

Stefan G. Sarafianos

d Center for Advanced Biotechnology and Medicine (CABM), Universitatea Rutgers, Departamentul de chimie și biologie chimică, 679 Hoes Lane, Piscataway, NJ 08854-5638, SUA

Lubna Kazi

Departamentul de Microbiologie, Facultatea de Medicină a Universității din Pennsylvania, 203A Johnson Pavilion, 36th Street și Hamilton Walk, Philadelphia, PA 19104, SUA

Sonia Navas-Martin

Departamentul de Microbiologie, Facultatea de Medicină a Universității din Pennsylvania, 203A Johnson Pavilion, 36th Street și Hamilton Walk, Philadelphia, PA 19104, SUA

Susan R. Weiss

Departamentul de Microbiologie, Facultatea de Medicină a Universității din Pennsylvania, 203A Johnson Pavilion, 36th Street și Hamilton Walk, Philadelphia, PA 19104, SUA

Tauseef R. Butt

și LifeSensors, Inc., 271 Great Valley Parkway, Malvern, PA 19355, SUA

Abstract

Sindromul respirator acut sever (SARS) 1 este o boală respiratorie care a fost raportată abia recent în Asia, America de Nord și Europa. După ce primul caz de boală la om a fost găsit în sudul Chinei la sfârșitul anului 2002, focarul s-a răspândit rapid în aproximativ 35 de țări de pe cinci continente, rezultând peste 8.000 de cazuri și 800 de decese. În prezent, nu există un regim de tratament eficient pentru SARS. Este evidentă atât necesitatea unui test de diagnostic fiabil, cât și a unui agent terapeutic (antiviral sau vaccin). Un coronavirus necunoscut anterior a fost identificat ca agent cauzal al SARS. Oamenii de știință de la CDC și alte laboratoare au determinat secvența genomică a acestui coronavirus și l-au numit SARS-CoV [1], [2], [3] .

Coronavirus, un gen din familia Coronaviridae, conține un grup de viruși ARN mari, pozitivi, înveliți, patogeni, care infectează multe specii de animale, inclusiv oameni. Acestea cauzează boli ale sistemului respirator, enteric și ale sistemului nervos central [4]. Secvența genomică a SARS-CoV oferă informații importante pentru dezvoltarea testelor de diagnostic și a vaccinurilor. Aceste informații oferă posibilitatea de a exprima orice proteină SARS-CoV la alegere pentru vaccinurile subunitare recombinate. Dezvoltarea metodelor de diagnostic și terapeutice pe bază de proteine ​​ar fi mult facilitată de capacitatea de a produce proteine ​​virale de înaltă calitate în cantități tratabile, care necesită inginerie, exprimare și purificare a proteinelor. Șase proteine ​​ale SARS-CoV, și anume Spike (S), Nucleocapsid (Nc), Plic (E), SARS polimerază (RdRp), SARS protează (3CL) și membrană (M), au devenit centrul eforturilor pentru a produce antivirale agenți și vaccinuri împotriva SARS. Proteinele SARS-CoV investigate în acest studiu sunt descrise pe scurt mai jos.

Un aport de proteine ​​SARS-CoV purificate ar fi valoros atât în ​​scopuri clinice, cât și în scopuri de investigație. Deși au fost dezvoltate mai multe strategii de-a lungul anilor pentru a exprima proteine ​​recombinante heterologe în celule bacteriene, drojdie, mamifere și insecte, expresia genelor heteroloage în bacterii este de departe cel mai simplu și mai ieftin mijloc disponibil pentru cercetare sau scopuri comerciale. Cu toate acestea, produsele genetice heteroloage nu reușesc adesea să-și atingă conformația corectă tridimensională (3-D) sau sunt pur și simplu exprimate foarte slab în Escherichia coli. Selecția ORF pentru proiecte de genomică structurală a arătat că doar ~ 20% din toate genele heterologe exprimate în E. coli fac proteine ​​solubile sau pliate corect [15], [16]. Au fost dezvoltate mai multe sisteme de fuziune genică, cum ar fi NusA, proteina de legare a maltozei (MBP), glutation-S-transferaza (GST), ubiquitina (UB) și tioredoxina (Trx) [17], [18]. Toate aceste metode convenționale au deficiențe, în primul rând exprimare ineficientă și/sau decolteu inconsecvent.

Am dezvoltat un nou sistem de fuziune SUMO care asigură niveluri crescute de exprimare a proteinelor heteroloage în E. coli și permite purificarea rapidă a proteinelor de interes [26], [32]. Raportăm aici aplicarea tehnologiei de fuziune SUMO la exprimarea și purificarea proteinelor majore SARS-CoV.

Materiale și metode

SARS-CoV 3CL Protează (3CL), SARS-CoV Nucleocapsidă (Nc) și SARS-CoV Fragment de proteină C-terminal Spike (Spk C) au fost fuzionate cu SUMO și exprimate în E. coli. Pentru exprimarea proteinelor, ADNc SARS-CoV a fost derivat din ARN celular infectat, furnizat de CDC, Atlanta, către S.R.W. (Universitatea din Pennsylvania).

Construcția vectorilor de expresie a proteinelor de fuziune SUMO-SARS-CoV

tabelul 1

Primeri PCR pentru amplificarea genelor proteinelor SARS-CoV