Abstract

fundal

Enterocolita necrotizantă (NEC) este o afecțiune inflamatorie intestinală acută care apare la sugarii prematuri în primele săptămâni după naștere. Sugarii care supraviețuiesc NEC prezintă adesea afectarea neurodezvoltării. Mecanismele care leagă leziunile NEC de neurodezvoltarea ulterioară sunt slab înțelese, dar pot include semnalizarea proinflamatorie în creierul imatur. Folosind porcii prematuri ca model pentru sugarii prematuri, am emis ipoteza că leziunile NEC intestinale severe sunt asociate cu efecte acute asupra hipocampului în curs de dezvoltare.

Metode

Porcii prematuri livrați prin cezariană (n = 117) au fost crescuți timp de 8 zile și au dezvoltat spontan severitatea variabilă a leziunilor NEC. Excitația neonatală, activitatea fizică și efectele neuritogene in vitro ale lichidului cefalorahidian (LCR) au fost investigate la porcii care prezintă leziuni NEC în colon (Co-NEC) sau în intestinul subțire (Si-NEC). Analiza transcriptomului hipocampic și qPCR au fost utilizate pentru a evalua expresiile genetice și relația lor cu procesele biologice, inclusiv neuroinflamarea și plasticitatea neuronală. Activarea Microglia a fost cuantificată prin stereologie. Răspunsul neuritogen la proteinele selectate a fost investigat în culturile primare de neuroni hipocampici.

Rezultate

Dezvoltarea NEC a redus rapid activitatea fizică a porcilor, mai ales atunci când au apărut leziuni în intestinul subțire. Si-NEC și Co-NEC au fost asociate cu 27 și, respectiv, 12 gene hipocampale exprimate diferențial (DEG). Acestea au inclus gene legate de neuroinflamare (adică., S100A8, S100A9, IL8, IL6, MMP8, SAA, TAGLN2) și hipoxie (adică., PDK4, IER3, TXNIP, AGER) și toți au fost reglementați în sus la porci Si-NEC. Gene legate de protecția împotriva stresului oxidativ (HBB, ALAS2) și oligodendrocite (OPALINE) au fost reglate în jos la porcii Si-NEC. LCR colectat de la porci NEC a promovat creșterea neuritei in vitro, iar proteinele S100A9 și S100A8/S100A9 pot media efectele neuritogene ale LCR legate de NEC asupra neuronilor hipocampici. Leziunile NEC nu au afectat numărul total de celule microgliene, dar au crescut semnificativ proporția de celule microgliale ameboide pozitive Iba1.

Concluzii

Leziunile NEC, în special atunci când sunt prezente în intestinul subțire, sunt asociate cu modificări ale expresiei genelor hipocampice care pot media neuroinflamarea și perturbarea formării circuitului neuronal prin diferențierea neuronală îmbunătățită. Intervențiile timpurii de protecție a creierului pot fi critice pentru sugarii prematuri afectați de leziuni NEC intestinale pentru a reduce disfuncțiile neurologice ulterioare.

fundal

Enterocolita necrotizantă (NEC) este o boală inflamatorie intestinală devastatoare acută care apare în principal la sugarii prematuri la scurt timp după naștere [1]. Studiile epidemiologice arată că 45% dintre supraviețuitorii NEC au fost afectați neurologic la vârsta de 20 de luni, cu un risc mai mare de paralizie cerebrală, auz, vizual, cognitiv și psihomotric [2, 3]. NEC severă care necesită intervenție chirurgicală este un factor de risc independent pentru leziunile cerebrale severe detectate la RMN, dezvoltarea mentală și psihomotorie slabă la aproximativ 2 ani [4, 5] și diferite deficite cognitive la vârsta școlară [6]. Este de conceput că NEC poate provoca leziuni acute în creierul în curs de dezvoltare și tulburări neurodezvoltare de durată ulterioare. Cu toate acestea, mecanismele subiacente și efectele acute asupra creierului asociate NEC sunt în mare parte necunoscute.

Porcii prematuri livrați la 90% gestație prezintă afectarea dezvoltării intestinului, imunității și creierului cu o susceptibilitate ridicată la infecții neonatale (adică NEC și sepsis) și deficite comportamentale și de învățare [21,22,23]. Astfel, o proporție mare de porci prematuri dezvoltă NEC spontan în prima săptămână după naștere atunci când sunt hrăniți cu diete sub-optime (de exemplu, formulă pentru sugari sau lapte donator uman) [24]. Spre deosebire de modelele de rozătoare, acest model nu necesită tratamente de hipotermie și hipoxie excesive [21]. Folosind porcii prematuri ca model pentru sugarii prematuri, am emis ipoteza că leziunile NEC ar induce modificări imediate ale hipocampului în curs de dezvoltare care ar putea ajuta la explicarea deficitelor neurodezvoltării ulterioare la supraviețuitorii NEC. Arătăm că în mod specific leziunile NEC localizate la nivelul intestinului subțire sunt asociate cu o activitate fizică redusă și reglarea în sus a genelor legate de inflamație în hipocamp. Expunerea neuronilor hipocampici la LCR de la porci cu NEC a favorizat creșterea neuritei in vitro, probabil prin factori legați de NEC în LCR, cum ar fi proteinele VEGF, CINC-3 și S100A9. Astfel, rezultatele noastre susțin ipoteza că leziunile NEC duc la efecte imediate asupra creierului în curs de dezvoltare la sugarii prematuri.

Metode

Model NEC spontan la porcii prematuri

O sută șaptesprezece purcei prematuri au fost eliberați de la opt scroafe prin operație cezariană în ziua 106 (90% din gestație, rasa daneză x White Large x Duroc, ferma Askelygaard, Danemarca). Porcii au fost adăpostiți în incubatoare individuale cu temperatură reglată (37-38 ° C) și alimentare cu oxigen (0,5-2,1/min, în primele 24 de ore). Porcii au fost introduși cu un tub orogastric de hrănire și un cateter ombilical pentru nutriția părintească și infuzie de plasmă de scroafă, așa cum s-a descris anterior [25]. Pentru a induce NEC spontan [21], porcii prematuri au fost hrăniți cu doze crescânde treptat de diferite tipuri de lapte donator uman (0-135 ml/kg/zi) și cu scăderea treptată a dozelor de nutriție parenterală (96-48 ml/kg/zi) timp de 8 zile, așa cum s-a descris anterior [24, 25].

Activitate în cușcă la domiciliu și înregistrări de excitare neonatală

În timpul perioadei de studiu, activitatea fizică a tuturor purceilor a fost înregistrată folosind camere video cu infraroșu conectate la un aparat de înregistrare a detectării mișcării. Proporția timpului activ a fost analizată cu software-ul aplicației PIGLWin (Ellegaard System, Faaborg, Danemarca), așa cum a fost descris anterior [26]. Excitația neonatală a fiecărui purcel a fost înregistrată ca timp de la naștere până la prima deschidere a ochilor, prima în picioare și prima plimbare, așa cum sa descris anterior [26].

Colectarea țesuturilor, evaluarea NEC și expresia citokinelor intestinale

Porcii au fost anesteziați, iar sângele a fost extras prin puncție cardiacă, urmată de eutanasie printr-o injecție intracardică de pentobarbital de sodiu (60 mg/kg). Fracțiile plasmatice heparinate au fost colectate și depozitate la - 80 ° C. Probele de LCR au fost colectate prin puncție sub-occipitală imediat după eutanasie, alicotate și depozitate la - 80 ° C. După determinarea greutății umede pe creier, creierul a fost disecat rapid și formațiunile de hipocamp stâng au fost înghețate rapid în azot lichid și depozitate la - 80 ° C până la prelucrarea ulterioară. Emisfera dreaptă a fost fixată în paraformaldehidă 4%. Greutatea uscată a creierului și conținutul de apă au fost determinate după uscarea restului de țesuturi cerebrale la o greutate constantă.

Analiza eșantionului de plasmă și LCR

Măsurarea spectrofotometrică a conținutului de oxihemoglobină a probelor de CSF a fost efectuată la A450 nm pentru a exclude probele care conțin contaminarea sângelui [29]. Concentrația totală de proteine ​​în probele de CSF și plasmă a fost măsurată cu setul de testare a proteinelor Pierce BCA. Albumina din plasmă și CSF, lactatul și glucoza au fost măsurate cu un analizor de sânge integral GEM premier 3000 (Laborator de instrumentare, Bedford, MA). Concentrația proteinei C reactive din plasmă (CRP) a fost măsurată prin ELISA (DY2648, sisteme de cercetare și dezvoltare, Minneapolis, MN, SUA).

Analiza excesului de neurită

Analize ARN-seq hipocampice

Hipocampi înghețați intact (n = 5-6 per grup) au fost omogenizate de un pulverizator de țesut criogen în azot lichid, iar ARN total a fost izolat cu RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Copenhaga, Danemarca). Integritatea probelor de ARN pentru analizele ARN-seq și qPCR a fost evaluată cu Agilent Bioanalyzer 2100 și RNA 6000 Nano Chips (Agilent Technologies, Glostrup, Danemarca) și a rezultat într-un număr mediu de integritate ARN (RIN) de 8,5 (SD ± 0,6). Bibliotecile de secvențiere au fost construite folosind kitul de pregătire a bibliotecii ARN NEBNext Ultra ™ pentru Illumina (New England BioLabs, Ipswich, MA, SUA), urmând recomandările producătorului. După amplificare, produsele au fost purificate cu sistemul AMPure XP și calitatea bibliotecii a fost evaluată pe sistemul Agilent Bioanalyzer 2100. Gruparea eșantioanelor codificate cu index a fost efectuată pe un sistem de generare a clusterelor cBot utilizând un kit HiSeq 4000 PE Cluster (Illumina, San Diego, CA, SUA). După generarea clusterelor, bibliotecile ADNc construite au fost secvențiate pe o platformă Illumina Hiseq 4000 (Illumina) și au fost generate citiri brute de 150 bp.

Citirile brute au fost tăiate pentru a produce citiri curate, inclusiv îndepărtarea secvenței adaptorului și citiri de calitate scăzută care conțin fie mai mult de 50% baze cu q valoare

Rezultate

NEC este asociat cu activitate fizică redusă, intestin și inflamație sistemică

În primul rând, am explorat dacă NEC a fost asociat cu o activitate fizică modificată. Timpul necesar până la prima deschidere a standului, mersului sau pleoapelor a fost similar între porcii NEC și No NEC (Fișa suplimentară 2: Tabelul S1). Mai precis, porcii Si-NEC au arătat o tendință de scădere a activității fizice începând cu ziua 6 (p = 0,1) și ulteriorp FIG. 1

acute

Diagnosticul NEC a fost susținut de analize ale citokinelor tisulare pro-inflamatorii [28], care au relevat creșteri semnificative ale expresiei IL-1β și IL-6 în intestinul subțire distal al animalelor Si-NEC (ambele p FIG. 2

Transcriptomul hipocampic și procesele biologice care se referă la leziunile NEC

Analiza GO a tuturor acestor gene legate de NEC a relevat patru procese biologice din hipocampus care ar putea fi legate de NEC, inclusiv „migrarea leucocitelor implicată în răspunsul la inflamație”, „reglarea procesului biosintetic de oxid nitric”, „reglarea remodelării țesuturilor” și „Reglarea pH-ului” (Fig. 3c; Fișa suplimentară 3: Tabelul S5). Majoritatea genelor implicate în aceste funcții au fost reglate în sus doar la porcii Si-NEC, cu excepția HBB (implicat în reglarea procesului biosintetic de oxid nitric), care a fost reglat în ambele grupuri NEC (Fig. 3c). Mai mult, am identificat 76 DEG între grupul Si-NEC versus grupul Co-NEC, iar 23 și 3 dintre aceștia au fost identificați anterior ca gene asociate cu Si-NEC și respectiv Co-NEC (Fig. 3a, Fișier suplimentar 3: Tabelul S4 și fișierul suplimentar 1: Figura S3c).

Mai multe gene specifice porcilor Si-NEC din fiecare categorie de procese biologice au fost apoi validate prin qPCR. Astfel, reglementarea în sus a PDK4 și S100A8 la porcii Si-NEC a fost confirmat (p FIG. 4

NEC este asociat cu activarea microgliei

Am continuat să studiem dacă modificările profilului citokinelor CSF și ale expresiei genei hipocampice la porcii NEC au fost legate de activarea microgliei rezidente. Hipocampusul de la porci cu sau fără NEC a fost colorat pentru markerul microgliei Iba1, iar numărul și morfologia celulelor microgliene au fost analizate folosind o abordare stereologică imparțială (Fig. 5a). Nu au existat diferențe statistice în numărul total de microglia între grupuri (p > 0,05, FIG. 5b). Analiza fenotipului morfologic al celulelor Iba1-pozitive a arătat că microglia cu procese ramificate au fost cel mai proeminent tip din toate cele trei grupuri. Cu toate acestea, au fost observate și microglii cu fenotipul amoeboid [38], iar numărul lor a crescut semnificativ în hipocampii ambelor grupuri NEC (p FIG. 5

S100A9 și heterocomplexul S100A8/S100A9 promovează creșterea neuritei

În cele din urmă, am investigat în continuare efectele biologice potențiale ale proteinelor codificate de gene hipocampice puternic asociate NEC, și anume S100A8 și S100A9 (calgranuline). Câțiva alți membri ai familiei S100, inclusiv S100A4 și S100A12, s-au dovedit anterior că promovează dezvoltarea neuritei din diferite tipuri de neuroni primari [57, 58]. În consecință, am investigat dacă S100A8, S100A9 și heterocomplexul S100A8/S100A9 (calprotectina) au afectat in vitro neuronii hipocampului în curs de dezvoltare. Neuronii primari au fost stimulați cu S100A9, S100A8 și S100A8/A9 diluate în serie timp de 24 de ore. Așa cum se arată în FIG. 6a, b, S100A9 și S100A8/A9 au promovat creșterea neuritei într-o manieră dependentă de doză, în timp ce nu a putut fi detectat niciun efect al S100A8 asupra extensiei neuritei. Datele susțin în continuare că proteinele induse de inflamație pot afecta neuronii hipocampului în curs de dezvoltare.

Discuţie

Este larg acceptat faptul că răspunsurile la inflamație și stres oxidativ apar adesea simultan, dar nu este clar dacă genele activate de hipoxie au roluri consecutive, corelative sau cauzale. DEG-urile Si-NEC au fost extrem de îmbogățite cu gene reglate în sus legate de hipoxie (a se vedea secțiunea „Rezultate”) și transcripturi care codifică în jos HBB și sintetaza sa ALAS2. Se știe că hemoglobina beta (HBB) este exprimată în neuroni [72], astrocite hipocampice și oligodendrocite mature [73] și este neuroprotectoră împotriva stresului oxidativ și nitrosativ [74]. HBB poate susține, de asemenea, metabolismul neuronal prin controlul epigenetic al histonelor [75] și funcțiilor neuronale ale mitocondriilor [72]. Astfel, reglarea descendentă a Si-NEC HBB poate deci să descopere neuronii pentru potențialul stres oxidativ și NO și să inhibe funcțiile mitocondriale ale hipocampului. Împreună, evenimentele legate de inflamație și hipoxie par responsabile de efectele Si-NEC asupra hipocampului în curs de dezvoltare.

Am observat o creștere a populației de microglie amoeboidă în hipocampusul porcilor NEC, care a constituit aproximativ 10-20% din totalul celulelor microgliene. Cu toate acestea, nu am observat o diferență între grupuri în numărul total de microglia. Abundența relativ scăzută a microgliei activate poate fi explicată prin reglarea în sus a ADM, deoarece adrenomedullina reglează în jos activarea microgliei indusă de LPS și scade producția de citokine pro-inflamatorii in vitro [76]. Mai mult, expresie reglată în sus a S100A8 și S100A9, și a receptorului lor RAGE, poate juca un rol, deoarece RAGE solubil poate funcționa ca un receptor momitor care atenuează efectele pro-inflamatorii ale proteinelor S100. În cele din urmă, reglementarea ascendentă legată de NEC USP18 (Fig. 3a, Fișier suplimentar 3: Tabelul S3), care codifică proteaza 18 specifică ubiquitinei, un regulator negativ al activării microgliei [77], prin urmare poate contracara efectul NEC asupra activării microgliei.

În general, am observat modificări mai profunde în expresia genelor hipocampice la porcii Si-NEC decât la porcii Co-NEC. Aceste modificări sugerează o potențială neuroinflamare, hipoxie și suferință oxidativă, care sunt mai evidente la porcii cu leziuni NEC în intestinul subțire decât în ​​colon. Acest lucru se poate datora faptului că intestinul subțire este mai vulnerabil la insulte la începutul vieții decât colonul [78, 79], iar NEC intestinal subțire este mai des legat de severitatea și mortalitatea crescută a bolii, de absorbția mai puțin a nutrienților și de riscul ridicat de translocație bacteriană [ 28]. Unii dintre porcii din grupul Si-NEC au avut, de asemenea, leziuni NEC în colon, totuși profilul de expresie genică hipocampic al acestor porci nu a fost diferit de porcii care au NEC doar în intestinul subțire (Fișa suplimentară 1: Figura S4). În afară de inflamația neonatală, malnutriția asociată NEC și creșterea slabă sunt, de asemenea, factori de risc pentru leziunile cerebrale și afectările neurodezvoltării la sugarii prematuri [80,81,82]. Cu toate acestea, este posibil ca factorii nutriționali să nu joace un rol critic în studiul de față, având în vedere că alimentația parenterală continuă pentru toate animalele și greutatea corporală nu au fost diferite între grupuri.

Concluzie

Rezultatele noastre explică de ce NEC la începutul vieții este legat de un rezultat neurologic slab mai târziu la sugarii prematuri. Arătăm că în special leziunile NEC din intestinul subțire sunt asociate cu activitatea fizică modificată și cu efecte profunde asupra expresiei genelor hipocampice, legate de inflamație și hipoxie. LCR de la porci NEC-pozitivi promovează creșterea neuritei și ramificarea neuronală, sugerând astfel că inflamația periferică poate interfera cu maturarea neuronală. Rezultatele arată importanța oferirii de intervenții de protecție a creierului copiilor prematuri spitalizați care suferă leziuni NEC severe. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru a investiga dacă inflamația asociată NEC în creierul în curs de dezvoltare afectează negativ formarea rețelei neuronale și funcția cognitivă pe termen mai lung.

Abrevieri

Chimiotratant neutrofil indus de citokine