Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Software, Scriere - schiță originală, Scriere - revizuire și editare

emisiile

Departamentul de Afiliere pentru Tehnologia Agricolă Internațională, Școala Absolventă pentru Tehnologia Agricolă Internațională, Universitatea Națională din Seul, Pyeongchang, Gangwon, Republica Coreea

Roluri Analiza formală

Adresa actuală: Departamentul de Științe Alimentare și Biotehnologie, Universitatea Sejong, Seul, Republica Coreea.

Departamentul de Afiliere pentru Știința Ecologică a Zootehniei, Institutul de Știință și Tehnologie Bio Bio, Universitatea Națională din Seul, Pyeongchang, Gangwon, Republica Coreea

Roluri Analiză formală, Software

Departamentul de afiliere pentru știința vieții animale, Universitatea Națională Kangwon, Chuncheon, Republica Coreea

Roluri Analiza formală

Departamentul de afiliere pentru știința și tehnologia animalelor, Universitatea Konkuk, Seul, Republica Coreea

Roluri Analiza formală

Departamentul de Afiliere pentru Știința Ecologică a Zootehniei, Institutul de Știință și Tehnologie Bio Bio, Universitatea Națională din Seul, Pyeongchang, Gangwon, Republica Coreea

Metodologia rolurilor, software

Departamentul de Afiliere pentru Știința și Tehnologia Animalelor, Universitatea Konkuk, Seul, Republica Coreea

Roluri Analiza formală

Departamentul de Afiliere pentru Știința Ecologică a Zootehniei, Institutul de Știință și Tehnologie Bio Bio, Universitatea Națională din Seul, Pyeongchang, Gangwon, Republica Coreea, Departamentul de Medicină Animală de Fermă, Colegiul de Medicină Veterinară, Universitatea Națională din Seul, Seul, Republica Coreea

Scrierea rolurilor - recenzie și editare

Departamentul de Tehnologie Agricolă Internațională, Școala Absolventă a Tehnologiei Agricole Internaționale, Universitatea Națională din Seul, Pyeongchang, Gangwon, Republica Coreea, Departamentul de Științe Ecologice ale Animalelor, Institutul de Științe și Tehnologie Bio Bio, Universitatea Națională din Seul, Pyeongchang, Gangwon, Republica Coreea

  • Rajaraman Bharanidharan,
  • Selvaraj Arokiyaraj,
  • Eun Bae Kim,
  • Chang Hyun Lee,
  • Yang Won Woo,
  • Youngjun Na,
  • Danil Kim,
  • Kyoung Hoon Kim

Cifre

Abstract

Puține studii au examinat efectele hrănirii rației mixte totale (TMR) versus furaje și se concentrează separat (SF) asupra producției de metan a rumegătoarelor. Prin urmare, acest studiu a comparat diferențele în producția de metan, caracteristicile ruminale, digestibilitatea totală a nutrienților din tract și microbiomul rumenului între cele două metode de hrănire din bochii Holstein. Un total de șase boi Holstein cu greutăți corporale inițiale de 540 ± 34 kg au fost împărțiți în două grupuri și repartizați la aceeași dietă experimentală cu două sisteme diferite de hrănire (TMR sau SF) într-un design crossover cu perioade de 21 d. Dieta experimentală conținea 73% concentrat și 27% furaje și au fost hrănite de două ori pe zi. Digestibilitatea totală a tractului proteinei brute, a fibrei neutre de detergent și a materiei organice nu a fost afectată de cele două sisteme diferite de hrănire. Steers hrăniți cu TMR au emis mai mult metan (138,5 vs. 118,2 L/zi; P Tabelul 1. Ingrediente și compoziția chimică a dietei bazale utilizate în experiment.

Măsurarea emisiilor de metan

Test de digestie și eșantionare galbenă

Analize chimice

Extracția ADN, PCR și secvențierea genei ARNr 16S

Cele 24 de probe de rumen colectate la 3 intervale de timp de la 4 boi Holstein alimentate de două sisteme diferite de hrănire au fost decongelate la temperatura camerei și ADN-ul genomic a fost extras din acestea folosind setul de sol NucleoSpin (Macherey-Nagel, Düren, Germania), cu modificări minore . Pe scurt, 5 ml de fluid galben dezghețat au fost centrifugați la 11.200 × g folosind Centrifuge Smart 15 (Hanil Science Industrial, Seoul, Coreea de Sud) și supernatantul a fost aruncat. Trei sute cincizeci de pl de tampon de liză și 75 pl de amplificator au fost adăugați la peletă și s-au rotit timp de 2 minute. Lichidul a fost transferat în NucleoSpin Bead Tube Type A care conține bile ceramice și a fost vortexat folosind bătătorul de bile Taco Prep (GeneReach Biotechnology Corp., Taiwan). Restul procedurii a fost urmat conform instrucțiunilor producătorului. Probele de ADN extrase au fost stocate la -20 ° C înainte de amplificările PCR. În prezentul studiu, exemplul direct F515 (5'-CACGGTCGKCGGCGCCATT-3 ') și exemplul invers R806 (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') care vizează domeniul V4 al ARNr 16S bacterian/arhaeal a fost selectat ca țintă pentru interogare comunitățile bacteriene și arheologice, deoarece acoperirea la nivel de gen a acestei regiuni sa dovedit a fi ridicată [19]. Acest exemplu stabilește ținte

312 pb din regiunile hipervariabile V4 care pot fi acoperite complet de Illumina MiSeq. Seturile de grunduri au fost modificate pentru a conține un adaptor Illumina și o regiune linker pentru secvențierea pe platforma Illumina MiSeq și, pe grundul invers, un cod de bare cu 12 baze pentru a permite multiplexarea probelor.

Pe scurt, reacția PCR a fost preparată utilizând ADN genomic (5 ng), tampon de reacție cu 25 mM Mg2 +, dNTP (200 mM fiecare), Ex Taq polimerază (0,75 unități; Takara Bio, Shiga, Japonia) și 5 pmol fiecare dintre primerii codați cu bare. Reacția PCR a fost efectuată la 94 ° C timp de 3 min pentru denaturarea inițială, 30 de cicluri de 45 s la 94 ° C, 1 min la 55 ° C, 90 s la 72 ° C pentru amplificare și 72 ° C timp de 10 min pentru prelungirea finală. Apoi, produsele PCR au fost cuantificate folosind Kit-ul de testare cu sensibilitate ridicată Quant-iTTM dsDNA (Invitrogen, CA, SUA) și toți ampliconii din cele 24 de probe de ADN au fost încărcați pe un gel de 1,5% -agaroză. Bandele au fost vizualizate și banda țintă a fost excizată și extrasă folosind QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germania). ADN-ul extras a fost utilizat pentru a construi biblioteca de secvențare V4 cu NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit (Nr. De cod: E7370S; New England Biolabs, Ipswich, MA, SUA), conform instrucțiunilor producătorului și biblioteca a fost secvențiată pentru împerechere- citire finală 250-bp în Illumina MiSeq.

Bioinformatică și analiză statistică

Citirile brute Illumina MiSeq au fost demultiplexate în funcție de codurile de bare și secvențele au fost filtrate de calitate (> = Q20). Citirile perechi procesate au fost concatenate într-o singură citire și fiecare citire a fost selectată pentru selectarea unității taxonomice operaționale (OTU) folosind UCLUST încorporat în QIIME 1.9.0 cu baza de date greengenes (gg_otus-13_8-release, 97% identitate nucleotidă ). Indicii diversității alfa, inclusiv indicii Chao1, Shannon și Simpson, au fost estimate utilizând software-ul PAST [20], iar citirile au fost rarificate pe baza valorilor medii de 10 iterații cu 10.000 de citiri pe eșantion. Pentru a identifica linii bacteriene care conduc gruparea comunităților microbiene în ambele sisteme de hrănire, am efectuat PCA (Principal Component Analysis) folosind funcția fviz_pca_biplot din pachetul FactoMineR din R [21]. Corelația non-parametrică a rangului Kendall a fost utilizată pentru a testa corelația dintre variabilele medii de producție și comunitățile bacteriene din lichidul de rumen folosind funcția de testare corectă din pachetul psihic al R [22]. Matricea de corelație rezultată a fost vizualizată într-un format heatmap folosind funcția plot_ly din pachetul plotly al lui R [23].

Datele privind emisiile zilnice de metan și digestibilitatea totală a tractului au fost analizate folosind procedura MIXED a SAS (Institutul SAS, Cary, NC, SUA). Modelul a inclus un efect fix al tratamentului dietetic și efectele aleatorii ale perioadei și animalelor cuibărite în cadrul tratamentului. Caracteristicile fermentației ruminale și diversitatea microbiană au fost analizate ca măsuri repetate utilizând SAS PROC MIXED [24]. Efectele fixe ale modelului au fost tratamentul dietetic și timpul de fermentare, precum și interacțiunea dintre acestea. Fiecare animal din cadrul tratamentului a fost considerat un efect aleatoriu. Structurile de covarianță adecvate au fost alese pe baza criteriului informației Akaike. Mijloacele au fost calculate folosind declarația LSMEANS, iar animalul a fost considerat unitatea experimentală. Diferențele de tratament au fost considerate semnificative la P 19 mm (P 0,05) în proporția de butirat în VFA totală a fost observată între sistemele de hrănire. Concentrația de NH3-N (P = 0,005) și proporțiile de izobutirat și izovalerat în VFA totală în SF au fost, de asemenea, mai mari (P Tabelul 2. Mijlocul cel puțin pătrat de producție de metan înregistrat la stevii hrăniți cu furaje și se concentrează fie ca rație mixtă totală (TMR) sau separat (SF) peste 24 de ore (n = 6).

Bogăția, estimarea diversității și bacteriile din rumen și compoziția arhaeală

Profilurile taxonomice pentru abundența relativă a nivelului de filum (A) și a nivelului de gen (B) a bacteriilor și archaea în ambele sisteme de hrănire clasificate prin reprezentare la> 0,5% din secvențele totale.

Diferențe în compoziția comunității bacteriene între sistemele de hrănire

Compoziția comunității bacteriene dintre sistemele de hrănire la nivelul filumului nu a avut diferențe (P> 0,05). Cu toate acestea, abundența filului Actinobacteria a avut tendința de a varia (P = 0,061) în sistemul SF (tabelul S3). La fel, la nivelul genurilor, abundența medie a Parabacteroides (P = 0,081), YRC22 (P = 0,082), Succiniclasticum (P = 0,063), Anaerovibrio (P = 0,071) și Succinivibrio (P = 0,074) au avut tendința de a fi mai mare în SF sistem. În mod similar, abundența genurilor CF231 și Coprococcus a fost mai mare (P Fig. 2. Analiza componentelor principale (PCA) care afișează corelații între comunitățile bacteriene ale stevilor hrăniți de două sisteme de hrănire diferite.

Matricea de corelație non-parametrică a lui Kendall a genurilor bacteriene dominante pe probele galbene. Genurile au fost incluse în matrice dacă s-au aflat în cel puțin 50% din boi și au reprezentat cel puțin 0,1% din comunitatea bacteriană în cel puțin unul dintre boi. Valorile medii ale diferitelor intervale de timp au fost incluse atât pentru abundența microbiană, cât și pentru parametrii de producție. Corelațiile puternice sunt indicate de intensitatea culorii. Culorile scării indică dacă corelația este pozitivă (mai aproape de 1, pătrate roșii) sau negativă (mai aproape de -1, pătrate albastre) între genuri și parametrii de eficiență.

Discuţie

Efectele sistemului de alimentare asupra emisiilor de CH4

În experimentul nostru, hrănirea TMR a dus la creșteri ale producției de CH4 (absolute) și randamentului de CH4, deși cantitatea de aport a fost aceeași ca pentru SF. DMI observate pentru a îndeplini cerințele nutriționale pentru o creștere zilnică medie de 0,65 kg au fost ușor mai mari decât cele prevăzute de standardul coreean de hrănire pentru bovine de carne [25]. Dar, randamentul CH4 (g/kg DMI) în experimentul actual a fost observat a fi mult mai mic decât cel raportat anterior [26] [27]. Cu toate acestea, acest lucru poate fi explicat prin calitatea ridicată a furajelor și proporția nivelului de concentrat din furajul din Coreea. Randament similar de CH4 (g/kg DMI) a fost observat într-un raport anterior din Coreea [28]. A fost raportată o relație puternică între producția de DMI și ruminal CH4 [29] [30]. Acest lucru indică faptul că creșterea DMI a dus la creșterea substratului fermentabil, incluzând atât carbohidrați structurali, cât și nestructurali [31]. Cu toate acestea, există dovezi că creșterea aportului de hrană a scăzut randamentul CH4 [32] [33] [34], ceea ce a fost explicat prin scăderea timpului mediu de retenție a rumenului, care, prin urmare, a scăzut gradul de fermentare a rumenului comparativ cu nivelurile scăzute de aport . [35] [36] [37]. Acesta este motivul pentru care experimentul nostru a fost efectuat la un nivel limitat de aport de furaje și nu ad libitum folosind TMR și SF.

Efectele sistemelor de hrănire asupra caracteristicilor de fermentare a rumenului și a abundenței bacteriene