Școala de Agricultură și Știința Alimentelor,

Școala de Agricultură și Știința Alimentelor,

Școala de Agricultură și Știința Alimentelor,

Școala de Agricultură și Știința Alimentelor,

Școala de Agricultură și Știința Alimentelor,

Școala de Medicină Veterinară,

Școala de Medicină Veterinară,

Școala de Medicină și Științe Medicale, University College Dublin, Belfield, Dublin;

Școala de Medicină Veterinară,

Școala de Agricultură și Știința Alimentelor,

Centrul de cercetare și inovare pentru animale și pășuni, Teagasc, Athenry, Co. Galway, Irlanda; și

Centrul de cercetare și inovare pentru animale și pășuni, Teagasc, Athenry, Co. Galway, Irlanda; și

Școala de Medicină Veterinară, Universitatea din Glasgow, Glasgow, Regatul Unit

Școala de Agricultură și Știința Alimentelor,

Adresa pentru solicitări de reimprimare și alte corespondențe: A.C.O. Evans, UCD Agriculture and Food Science Center, Belfield, Dublin 4, Irlanda. (e-mail: [e-mail protejat]).

Abstract

mediul metabolic al femeilor poate fi afectat atât de factorii de stres cronici, cât și de cei acută în momentele critice ale ciclului reproducerii și poate fi dăunător funcției reproductive (7, 17). De exemplu, la animalele de carne de vită, restricția dietetică acută a redus concentrațiile sistemice de hormoni metabolici (insulină, IGF-I) și a dus la creșterea numărului de foliculi nonovulatori; în plus, foliculii care au ovulat au avut o rată de creștere redusă, diametrul maxim și secreția de estradiol (8, 9, 52, 53). Această situație este similară cu adaptările metabolice observate la lactație la începutul perioadei postpartum la vaca de lapte care alăptează, atunci când prezintă profiluri metabolice similare și au funcție foliculară preovulatorie redusă, adică, estradiol sistemic redus, în ciuda creșterii diametrului foliculului ovulator (68). Manipularea dietetică pentru a depăși acești factori de stres metabolici prin creșterea nutrițională a insulinei circulante a scurtat intervalul de la fătare la prima ovulație (32) și a crescut numărul de foliculi mici (300 au fost, de asemenea, îndepărtați.

ANOVA

Analiza căii de ingeniozitate

qRT-PCR

Tabelul 1. Numărul de acces, simbolul genei și numele utilizate pentru a genera secvențe exemplare înainte și inversă pentru analiza qRT-PCR

Toți primerii au fost utilizați la o concentrație finală de 300 nM.

Analiza celei mai adecvate normalizări qRT-PCR pentru celulele theca și granuloase a fost efectuată folosind aplicația geNorm din software-ul Biogazelle qBase plus (http://www.qbaseplus.com; Biogazelle, Ghent, Belgia) (35). În experimentul 1, factorul optim de normalizare a fost calculat ca medie geometrică a DDX39B și UBIQ pentru celulele theca, în timp ce media geometrică a DAD1 și UBIQ a fost recomandat pentru celulele granuloase. Pentru probe în experimentul 2, factorul optim de normalizare a fost calculat ca medie geometrică a DDX39B și ACTB pentru celulele theca, în timp ce media geometrică a DAD1 și UBIQ a fost recomandat pentru celulele granuloase. Toate datele de expresie pentru genele de interes au fost calibrate normalizate, iar valorile de expresie pentru fiecare genă au fost determinate în unități arbitrare.

Analiza statistică a măsurătorilor fiziologice și qRT-PCR

Probele de ser, plasmă și fluid folicular și rezultatele qRT-PCR au fost analizate folosind sisteme de analiză statistică (Institutul SAS, Cary, NC). Normalitatea și omogenitatea varianței datelor au fost determinate folosind histograme, qqplots și procedura UNIVARIATE în SAS. Când a fost detectată eterogenitatea varianței, datele au fost transformate prin ridicarea variabilei la puterea lambda, determinată de analiza transformării Box-Cox utilizând procedura TRANSREG în SAS. Testele de ipoteză (P valori) au fost efectuate acolo unde este cazul pe date transformate și netransformate. Mediile celor mai mici pătrate și erorile standard reflectă analiza datelor netransformate.

În experimentul 1, efectul stadiului de dezvoltare a foliculului, starea animalului (vaca/junincă) și interacțiunea acestora asupra analiților serici, lichidului folicular și expresia genei relative au fost determinate folosind metodologia modelului mixt (PROC MIXED) în SAS. În experimentul 2, efectul tratamentului (1,2 M vs. 0,4 M) asupra analiților plasmatici, fluidului folicular și expresia genei relative a fost determinat utilizând procedura PROC GLM în SAS. Toate datele privind expresia genelor pentru genele de interes sunt prezentate ca medii ± SE ale valorilor de expresie calibrate, normalizate, relative în unități arbitrare. Coeficienții de corelație Pearson dintre analiții de sânge și valorile expresiei genelor au fost determinați utilizând PROC CORR al SAS. Coeficienții de corelație au fost clasificați ca fiind puternici (r> 0,6), moderate (r între 0,4 și 0,6) sau slabi (r

Tabelul 2. Concentrațiile de analiți (± SE) în ser colectate în ziua recuperării țesuturilor la vacile de lapte și junincile care alăptează

VaciPăsăriP ValoareAnimale, n1617 Glucoza, mmol/l3,42 ± 0,094,11 ± 0,09 6 ng/ml (8,1 ± 0,51 ng/ml, medie ± SE), în timp ce concentrațiile au fost ≤0,22 ng/ml pentru toate animalele în stadii de diferențiere și luteinizare. Diametrul foliculului a crescut semnificativ de la selecție (10,2 ± 0,41 mm) la diferențiere (16,9 ± 0,73 mm)P

efectul

FIG. 1.Diametrul mediu (± SE)A) măsurată după disecție și concentrațiile de lichid folicular de estradiol (B), progesteron (C) și colesterol (D) pentru foliculul dominant nou selectat (Selecție: vaci n = 5, juninci n = 6), folicul dominat diferențiat (Diferențierea: vaci n = 7, juninci n = 5), și folicul dominant luteinizat (luteinizare: vaci n = 4, juninci n = 6) pentru vacile care alăptează (bare negre) și juninci (bare albe). Efectele generale ale tratamentului sunt date în fiecare panou pentru fiecare caracteristică foliculară cu semnificație stabilită la P 0,05.

Modificări temporale în expresia genică a foliculilor dominanți în etape distincte ale undei foliculului.

FIG. 2.Analiza între grupuri (BGA) utilizând analiza corespondenței datelor ARN-Seq pentru thecaA) și granuloasă (B) celule pe baza profilului transcripțional global pentru foliculul dominant nou selectat (SDF), foliculul dominant diferențiat (DDF) și foliculul dominant luteinizat (LDF) la juninci și vaci care alăptează.


FIG. 3.Numărul de transcrieri exprimate diferențial (DEG) în celulele teca și granuloasă bovine din foliculii dominanți colectați din junincele de lapte (n = 17) și vaci de lapte care alăpteazăn = 16) la Selecție (vaci n = 5, juninci n = 6), Diferențierea (vaci n = 7, juninci n = 5) și luteinizare (vaci n = 4, juninci n = 6) etape ale dezvoltării foliculului preovulator. Numerele din dreptunghiuri indică numărul de DEG-uri în timpul diferențierii (selecție vs. diferențiere) și luteinizare (diferențiere vs. luteinizare) în celulele theca și granuloase. Numerele din ovale indică numărul de DEG între juninci și vaci care alăptează în stadiul dezvoltării foliculilor în celulele theca și granuloase. Săgețile de lângă cifre indică direcția de schimbare (în sus sau în jos reglementate).

Validarea qRT-PCR a datelor ARN-Seq.

Patru gene din celulele granuloase au fost selectate pentru validare pentru a confirma că foliculii au fost recuperați în etapele corecte ale dezvoltării foliculului dominant. A existat un efect semnificativ de etapă pentru expresia ARNm a enzimelor steroidogene și a receptorilor gonadotrofinei (P

FIG. 4.Valorile relative ale expresiei pentru 3BHSD (A), CYP19A1 (B), FSHR (C), și LHCGR (D) și celule granuloase bovine. Valorile expresiei medii (± SE) sunt valori calibrate ale expresiei relative normalizate (CNRQ) în unități arbitrare (AU) și sunt date pentru vacile de lapte care alăptează (bare negre solide) și juninci (bare albe solide) pentru noua dominantă selectată folicul (Selecție: vaci n = 5, juninci n = 6), folicul dominat diferențiat (Diferențierea: vaci n = 7, juninci n = 5) și folicul preovulator luteinizat (luteinizare: vaci n = 4, juninci n = 6). Efectele generale ale tratamentului sunt date în fiecare panou pentru fiecare genă cu semnificație stabilită la P 0,05.

Analiza căii.

Tabelul 3. Top cinci căi canonice cu cele mai mici valori P din testul exact al lui Fisher pentru căile generate de IPA pentru celulele theca și granuloase de la juninci și vaci care alăptează în timpul diferențierii foliculului (selecție vs. diferențiere) și luteinizare (diferențiere vs. luteinizare)

Caracterizarea biosintezei căii canonice a steroizilor în experimentul 1.

Având în vedere că concentrațiile de steroizi ai lichidului folicular au fost nu numai diferite între etapele de dezvoltare a foliculilor, ci și diferite între juninci și vaci care alăptează, am ales să ne concentrăm această lucrare asupra caracterizării diferențelor în componentele cheie ale biosintezei căii steroizilor pentru a identifica genele țintă din cadrul această cale care poate fi susceptibilă la influențe metabolice. Interesant, în celulele theca, vacile lactate care alăptează au avut o expresie mai mare de cinci (SQLE, SC4MOL, SC5DL, EPB, NQO1) gene din biosinteza căii steroizilor decât juninci la diferențiere. Pentru a confirma efectele asupra stării temporale și a animalelor (vacă/junincă) asupra unor astfel de modificări în expresia genei, s-a folosit qRT-PCR pentru validarea a două gene pe care ARN-Seq le-a indicat că au fost exprimate diferențial între vaci și juninci la diferențiere (SC4MOL și SQLE) și, de asemenea, prima enzimă din cale (HMGCR) care nu a fost diferit între vaci și juninci (Fig. 5). Similar cu rezultatele ARN-Seq, expresia lui HMGCR, SC4MOL, și SQLE a crescut de la selecție la diferențiere și a scăzut în timpul tranziției de la diferențiere la luteinizare (P

FIG. 5.Valorile relative ale expresiei pentru HMGCR (A), SQLE (B), SC4MOL (C), și STEA (D) și celulele teca bovine. Valorile medii (± SE) sunt valori CNRQ în UA, date pentru vacile de lapte care alăptează, n = 16) și juninci (bare albe solide, n = 17) pentru foliculul dominant nou selectat (selecție: vaci n = 5, juninci n = 6), folicul dominat diferențiat (Diferențierea: vaci n = 7, juninci n = 5), și folicul preovulator luteinizat (luteinizare: vaci n = 4, juninci n = 6). Efectele generale ale tratamentului sunt date în fiecare panou pentru fiecare genă cu semnificație stabilită la P 0,05.

Experimentul 2

Profilurile metabolice și caracteristicile fluidului folicular al junincilor de vită oferite 1.2 vs. 0,4 M.

Concentrațiile plasmatice de glucoză, insulină și IGF-I au fost semnificativ mai mari la junincile de vită hrănite cu 1,2 M decât cele oferite 0,4 M (Tabelul 4). Junincele hrănite cu 1,2 M au avut, de asemenea, tendința de a avea concentrații plasmatice mai mari de colesterol decât cele hrănite cu 0,4 M (P = 0,084). Junincile hrănite cu 0,4 M au avut concentrații semnificativ mai mari de BHB.

Tabelul 4. Cea mai mică pătrată înseamnă concentrații de analiți în plasmă colectați în ziua recuperării țesutului și diametrul foliculului dominant măsurat după disecție și concentrații de lichid folicular de estradiol, progesteron, IGF-I și colesterol pentru foliculul dominant nou selectat pentru juninci martor (1,2 M) și restricționate (0,4 M)

* E2, estradiol; P4, progesteron.

Nu a existat nicio diferență în diametrul foliculului (folicul dominant timpuriu din primul val al ciclului) între junincele oferite 1,2 M față de cele oferite 0,4 M. Cu toate acestea, junincile oferite 1,2 M au avut concentrații semnificativ mai mari de lichid folicular de estradiol, IGF-I și colesterolul decât cele oferite 0,4 M. Concentrațiile de lichid folicular progesteron nu au diferit între grupuri.

Caracterizarea biosintezei căii canonice a steroizilor în experimentul 2.

În experimentul 2, pentru a determina dacă relația dintre STEA expresia și producția de estradiol au rămas valabile într-un alt model de stare metabolică compromisă, qRT-PCR a fost efectuată pe gene candidate în calea biosintezei colesterolului (HMGCR, SQLE, SC4MOL, STAR) în cadrul celulelor theca identificate ca fiind semnificativ diferite între vacile de lapte care alăptează și junincele din experimentul 1. Foliculii din junincele hrănite cu 1,2 M au avut o expresie a ARNm mai mare pentru SC4MOL (P

FIG. 6.Valorile relative ale expresiei pentru HMGCR, SC4MOL, SQLE, și STEA în celulele teca bovine. Valorile medii (± SE) ale expresiei sunt valori CNRQ în UA, date pentru junincele oferite 1.2 întreținere (M), n = 8) și 0,4 M (bare albe, n = 11).


FIG. 7.Un model schematic al unei selecții de gene implicate în biosinteza colesterolului de novo și steroidogeneza în foliculul ovarian preovulator bovin (enzimele sunt prezentate în dreptunghiuri). Absorbția colesterolului extracelular sub formă de lipoproteine ​​cu densitate mare (HDL) și lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL) din circulație se realizează deși se leagă cu receptorii lor respectivi (LDLR și SRB1) de membrana celulară thec, în timp ce colesterolul intracelular este generat de sinteza novo din acizi grași. Colesterolul celular liber este transportat de la membrana mitocondrială externă la membrana mitocondrială internă de către STAR. Aceasta este o etapă de limitare a vitezei în formarea estradiolului pe calea steroidogenă care implică enzime (dintre care unele sunt prezentate) atât în ​​celulele theca, cât și în celulele granuloase. Activarea și inhibarea expresiei StAR sunt reglementate de hormoni trofici, factori de creștere, diferiți factori de transcripție și căi de semnalizare multiple (a se vedea textul pentru mai multe detalii).

Coeficienții de corelație pentru asocierea dintre concentrațiile de steroizi ai fluidului folicular și trăsăturile metabolice ale junincilor de vită cu gene implicate în biosinteza colesterolului în celulele theca bovine sunt prezentați în tabelul 5. Au fost observați coeficienți de corelație puternici pozitivi între concentrațiile de estradiol al fluidului folicular cu nivelurile de expresie a ARNm pentru SQLE și STEA și coeficienți de corelație moderate cu niveluri de expresie a ARNm pentru HMGCR și SC4MOL. Corelații între nivelurile de expresie ale ARNm pentru STEA și concentrațiile circulante de IGF-I și concentrațiile de colesterol din fluidul folicular au fost moderat pozitive. Mai mult, nivelurile de expresie ale ARNm pentru STEA au fost corelate negativ cu concentrațiile circulante de BHB.

Tabelul 5. Corelațiile genelor implicate în biosinteza colesterolului în celulele teca bovine cu concentrații de steroizi de lichid folicular și trăsături metabolice ale junincilor de vită (n = 19)

Coeficientul de corelație cu caractere aldine este diferit de zero (P † P * P ** P *** P 1 Versiunea online a acestui articol conține materiale suplimentare.