Secțiunea Neurobiologie, Fiziologie și Comportament, Divizia de Științe Biologice,

Secțiunea Neurobiologie, Fiziologie și Comportament, Divizia de Științe Biologice,

Departamentul de Pediatrie și

Programul Rowe în genetică, Școala de Medicină, Universitatea din California, Davis, California 95616-8519

Programul Rowe în genetică, Școala de Medicină, Universitatea din California, Davis, California 95616-8519

Secțiunea Neurobiologie, Fiziologie și Comportament, Divizia de Științe Biologice,

Abstract

Rata metabolică, măsurată prin consumul de oxigen, crește în hipergravitatea cronică (22). În 2 G, mamiferele mici cresc consumul de oxigen liniar cu greutatea corporală totală (24, 25). Mai mult, la mai multe specii, cerințele nutriționale de întreținere s-au dovedit a fi direct legate de nivelul de accelerație, în limita toleranței cronice la G (30, 31). O scădere corespunzătoare a cheltuielilor de energie metabolică a fost documentată la maimuțele rhesus expuse mediilor de zbor spațial cu microgravitație (Cosmos 2044 și 2229) (11, 32). La aceste maimuțe, cheltuielile totale de energie metabolică, măsurate prin cifra de afaceri a apei dublu etichetate, au fost reduse cu ~ 40% (11, 32). Aceste descoperiri reprezintă cea mai directă demonstrație a costului gravitației metabolice. Din păcate, constanța câmpului gravitațional al Pământului maschează această relație importantă între costul metabolic al vieții și mediul gravitațional.

Distribuția proporțională a masei corporale între grăsime și componentele lipsite de grăsime a fost, de asemenea, studiată în medii hiperdinamice. Primele câteva zile de centrifugare cronică sunt însoțite de scăderea masei corporale (3) și modificarea metabolismului glucozei și a grăsimilor (6, 7). În timpul expunerii la un mediu hiperdinamic, a fost observată o pierdere de grăsime corporală la șoareci (23), șobolani (34), iepuri (19) și pui (3). Această reducere a componentei de grăsime corporală a masei corporale poate fi destul de mare; de exemplu, puii scad de la 30% grăsime corporală la 1 G la 3% la 3 G (3). Scăderea grăsimii corporale sugerează o schimbare fundamentală în utilizarea substratului în timpul expunerii la un mediu hiperdinamic. Mai mult, o astfel de schimbare metabolică poate semnifica un rol funcțional modificat pentru adipocite și miocite în reglarea metabolismului intermediar și a homeostaziei energetice pe parcursul a 2 G.

Proteinele de decuplare mitocondriale (UCP) au fost implicate ca potențiali potențatori ai cheltuielilor de energie. Rolul fiziologic in vivo al UCP nu este cunoscut; cu toate acestea, UCP funcționează putativ atât pentru a crește termogeneza țesuturilor, cât și pentru a regla utilizarea lipidelor ca substrat combustibil (29). Primul UCP descris a fost UCP1, localizat în țesutul adipos maro. Mai recent, UCP2 și UCP3, omologi ai UCP1 adipos maro, au fost descriși în țesuturile centrale și periferice, inclusiv în centrele homeostatice ale creierului (16, 28), precum și în mușchiul scheletic, țesutul adipos alb, ficatul, splina și inima (2)., 8). Atât UCP2, cât și UCP3 au proprietăți de decuplare in vitro similare cu UCP1 (2, 8). Crearea liniei transgenice UCP2/3 de șoareci oferă o oportunitate de a testa posibile roluri in vivo ale UCP2 și UCP3. Șoarecii din acest studiu au fost derivați dintr-o linie transgenică care a supraexprimat UCP2 în splină, hipotalamus, gastrocnemius și țesutul adipos alb și UCP3 în mușchiul gastrocnemius. Se consideră că constructul conține toate elementele promotor pentru exprimare în țesuturile normale, naturale. Mai mult, Northern blots au confirmat că UCP2 și UCP3 sunt produse în toate țesuturile normale și nu în altele.

Paradigma experimentală 2-G oferă un instrument unic pentru investigarea rolului fiziologic in vivo al UCP2 și UCP3 în termoreglare și adipozitate. Datorită rolurilor potențiale ale UCP2 și UCP3 în medierea termogenezei termoreglare prin creșterea termogenezei țesutului bazal (metabolism) sau facultativ (producție crescută de căldură), expunerea la 2 G poate provoca un răspuns diferențial în Tb la șoarecii transgenici și de tip sălbatic. Mai mult, deoarece UCP2 și UCP3 au fost implicați ca regulatori ai lipidelor ca substrat combustibil, populația transgenică poate demonstra metabolismul adipos diferențial în raport cu netransgenicele în timpul expunerii la 2 G. În acest context, UCP2/3 poate avea un rol metabolic adaptativ pentru anumite țesuturi în perioadele de mobilizare crescută a acizilor grași. Un astfel de rol presupus a fost propus anterior pentru UCP2/3 (4).

Astfel, acest studiu testează ipotezele că supraexprimarea UCP2/3 va fi1) modificați profilul de reglare Tb la 2 G și2) crește utilizarea grăsimii, evaluată prin modificări ale compoziției corpului și ale masei adipoase.

Transgenici.

Șoarecii transgenici au fost fabricați utilizând o clonă de cromozom artificial bacterian uman (BAC) de 80 kb. Clona BAC a fost izolată de Genome Systems prin hibridizare cu o sondă de ADNc UCP2 umană. Această clonă conține toate UCP2 și UCP3. Acestea sunt organizate UCP3 și apoi UCP2 în orientarea 5 ′ la 3 ′. În plus, există 8 kb 3 ′ de UCP2 și ∼40 kb 5 ′ de UCP3. Acest lucru a fost determinat de secvențierea directă a subclonelor care conțin UCP2, prin demonstrarea faptului că UCP3 este 8 kb 5 ′ de UCP2 și din informații publicate cu privire la structura genei și dimensiunile intronului UCP2 și UCP3 umane. Șoarecii transgenici au fost verificați prin PCR și cu expresie tisulară, utilizând analiza Northern blot. Îngrijirea șoarecilor din experiment a îndeplinit standardele stabilite de Institutul Național de Sănătate (NIH) Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor Davis al Universității din California.

Animale și biotelemetrie.

Opt bărbați adulți (28-33 g) șoareci transgenici UCP2/3 și nouă bărbați adulți (29-32 g) coechipieri netransgenici (de tip sălbatic) (Mus musculus) au fost implantate intraperitoneal cu transmițătoare de biotelemetrie (disc VM-FH; ​​Minimitter, Sunriver, OR) pentru a înregistra Tb și activitatea. A fost inițiat și menținut un plan chirurgical de anestezie cu utilizarea a 3% izofluran în oxigen pur de calitate medicală, administrat de un vaporizator de izofluran reglabil (Viking Medical Products, Medford Lakes, NJ). Cu utilizarea tehnicilor aseptice, s-a efectuat o celiotomie de linie mediană și un transmițător sterilizat a fost introdus în cavitatea peritoneală. Toate inciziile au fost suturate și tratate cu lidocaină și un antibiotic topic. Șoarecii s-au recuperat pe un tampon de încălzire, cu Tb monitorizat constant printr-o sondă colonică.

Carcasă și centrifugă.

După 10 zile de recuperare, șoarecii au fost plasați pe o centrifugă cu diametrul de 4,6 m. Animalele au fost adăpostite individual în cuști standard de șoareci din plastic cu alimente (Dieta de laborator) și apă ad libitum. Fiecare cușcă a fost plasată deasupra unui receptor de telemetrie interfațat cu un sistem de achiziție de date cu microcomputer (Data Sciences). Valorile Tb au fost înregistrate la intervale de 5 minute, iar datele despre activitate au fost colectate în coșuri de 5 minute. Cuștile au fost adăpostite în module de centrifugă, care asigurau ventilație, un ciclu lumină-întuneric de 12: 12-ore, o temperatură ambiantă de 25 ± 1 ° C și izolare vizuală. Modulele care conțin colivii au fost montate cu un grad de libertate, asigurându-se astfel că câmpul G net era întotdeauna perpendicular pe podeaua coliviei. O perioadă de 2 săptămâni de 1 G a fost utilizată pentru a stabili nivelurile inițiale, după care șoarecii au fost expuși la 2 G prin centrifugare timp de 8 săptămâni. Centrifugarea a fost întreruptă de două ori pe săptămână pentru perioadele de 15-15 minute necesare pentru creșterea animalelor.

Compoziția adipoasă și corporală.

La sfârșitul expunerii la 2-G, șoarecii au fost scoși din centrifugă și uciși imediat. Tampoanele adipoase (mezenterice, retroperitoneale, femurale și epididimale) au fost îndepărtate și cântărite. Compoziția corpului a fost determinată prin metoda Bell și Stern (1). Pe scurt, carcasele au fost preparate prin eviscerare și liofilizate timp de 7 zile (sau până la 2 cântăriri zilnice consecutive diferite de cel mult 2%) și apoi cântărite pentru a obține masa uscată și procent de apă din corp. Lipidele au fost apoi extrase cu eter timp de 7 zile și acetonă extrase timp de 5 zile. Carcasa a fost apoi re-congelată timp de 24 de ore și cântărită pentru a determina procentul de grăsime corporală.

Statistici.

Faza, media și activitatea Tb și ritmurile de activitate au fost determinate cu utilizarea unui program de potrivire de fază (analiză de regresie armonică a celor mai mici pătrate) care a utilizat un algoritm bazat pe Fourier. ANOVA cu măsuri repetate a fost utilizat pentru a compara condițiile gravitaționale [1 G (control), timpuriu 2 G (adaptare) și tardiv 2 G (recuperare)]. Comparații medii specifice au fost făcute utilizând un test Tukey post hoc (SPSS). Pentru masa adipoasă, comparațiile dintre grupurile experimentale și cele de control au fost analizate de către nepereche t-Test. Nivelul de semnificație al P

temperaturii

FIG. 1.Graficele datelor referitoare la temperatura corpului (Tb) din tip sălbaticstânga) și transgenice (dreapta) șoareci. A și D: Tb la 1 G.B și E: Tb la începutul 2 G.C și F: Tb la sfârșitul 2 G.

Tabelul 1. Temperatura și activitatea corpului în mediile 1-G, 2-G timpurii și 2-G târzii