Ichiro Tokubuchi

1 Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină a Universității Kurume, Kurume, Japonia

benefice

Yuji Tajiri

1 Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină a Universității Kurume, Kurume, Japonia

Shimpei Iwata

1 Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină a Universității Kurume, Kurume, Japonia

Kento Hara

1 Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină a Universității Kurume, Kurume, Japonia

Nobuhiko Wada

1 Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină a Universității Kurume, Kurume, Japonia

Toshihiko Hashinaga

1 Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină a Universității Kurume, Kurume, Japonia

Hitomi Nakayama

1 Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină a Universității Kurume, Kurume, Japonia

Hiroharu Mifune

2 Institutul de Experimentare a Animalelor, Școala de Medicină a Universității Kurume, Kurume, Japonia

Kentaro Yamada

1 Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină a Universității Kurume, Kurume, Japonia

Conceptualizare: YT HN KY.

Arhivarea datelor: YT.

Analiza formală: ACEASTA.

Achiziție de finanțare: YT.

Investigație: IT YT SI KH.

Metodologie: IT HM NW TH.

Administrarea proiectului: YT.

Resurse: YT.

Software: YT.

Supraveghere: KY.

Validare: IT HN.

Vizualizare: YT HM.

Scriere - schiță originală: ACEASTA.

Scriere - recenzie și editare: YT KY.

Date asociate

Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierul său de informații de suport.

Abstract

Obiectiv

Se știe că metformina are un efect benefic asupra greutății corporale și a compoziției corpului, deși mecanismul precis nu a fost încă elucidat. Scopul acestui studiu este de a investiga efectele metforminei asupra metabolismului energetic și a factorilor antropometrici atât la subiecții umani, cât și la șobolani.

Metode

În studiile la om, metformina (1500 mg/zi) a fost administrată la 23 de subiecți sănătoși și 18 pacienți cu diabet de tip 2 timp de 2 săptămâni. Parametrii metabolici și metabolismul energetic au fost măsurați în timpul unui test de toleranță la masă, dimineața înainte și după tratamentul metforminei. În studiile la animale, șobolanii SD cu vârsta de 13 săptămâni au fost hrăniți cu 25-26 g de chow standard numai în timpul fazei întunecate de 12 ore fie tratate cu metformină (2,5 mg/ml în apă potabilă), fie nu timp de 2 săptămâni, și parametrii metabolici, antropometrici factorii și metabolismul energetic împreună cu expresiile legate de oxidarea grăsimilor și termogeneza adaptivă au fost măsurați fie în post, fie post-prandial la vârsta de 15 săptămâni.

Rezultate

Concentrația plasmatică post-prandială de lactat a fost semnificativ crescută după tratamentul cu metformină atât la subiecții sănătoși, cât și la pacienții diabetici. Deși cheltuielile cu energia (EE) nu s-au modificat, coeficientul respirator de bază (RQ) a fost semnificativ redus, iar RQ post-prandial a fost semnificativ crescut invers, după tratamentul cu metformină în ambele grupuri. Prin administrarea de metformină la șobolani SD timp de 2 săptămâni, nivelurile plasmatice de lactat și piruvat au crescut semnificativ atât în ​​starea de post cât și în cea post-prandială. RQ în timpul unei perioade de repaus alimentar a fost redus semnificativ la șobolanii tratați cu metformină comparativ cu martorii fără efect asupra EE. Tratamentul cu metformină a determinat o reducere semnificativă a masei de grăsime viscerală comparativ cu controalele însoțite de o reglare crescută a enzimei legate de oxidarea grăsimilor în ficat, UCP-1 în țesutul adipos brun și UCP-3 în mușchiul scheletic.

Concluzie

Din rezultatele obținute, efectele benefice ale metforminei asupra reducerii grăsimii viscerale au fost demonstrate probabil printr-un mecanism pentru o potențială mutare a resursei de combustibil în oxidarea grăsimilor și o reglare în sus a termogenezei adaptive, independent de efectul anorexigen al acestui medicament.

Introducere

În ediția din 2013 a Federației Internaționale a Diabetului (IDF) Diabetes Atlas, prevalența diabetului în regiunea Pacificului de Vest (WP) a fost raportată a fi de 8,6% în 2013 sau de 138 de milioane de adulți și se estimează că va crește la 11,1%, sau 201 milioane de adulți, în 2035 [1]. Diabetul de tip 2 reprezintă 95% din diabetul zaharat la pacienții cu diabet japonez, iar numărul pacienților crește în continuare, împreună cu numărul persoanelor supraponderale/cu obezitate care reflectă factori de mediu, inclusiv supraalimentarea și lipsa exercițiilor fizice. Cu toate acestea, este de interes faptul că prevalența diabetului zaharat la persoanele asiatice este aproape aceeași cu cea din Caucazian, în ciuda IMC-ului lor mult mai scăzut. Motivul este probabil genetic și se datorează probabil capacității lor mai mici de secreție de insulină în comparație cu cea din Caucaz [2]. Prin urmare, se crede că persoanele asiatice, inclusiv japonezii, sunt mult mai susceptibile de a fi afectate de diabet decât persoanele din țările occidentale, în era satietății.

Metode

Studii umane

Subiecte

23 de voluntari sănătoși (16 bărbați, 28 ± 3 ani, IMC 22,0 ± 4,1 kg/m 2) și 18 pacienți fără diabet zaharat cu diabet zaharat de tip 2 (10 bărbați, 42 ± 16 ani, IMC 31,2 ± 6,7 kg/m 2, HbA1c 9,1 ± 2,1%) au fost înscriși în prezentul studiu. Subiecții sănătoși au fost recrutați prin publicitate, iar subiecții diabetici au fost recrutați aleatoriu de la pacienții care fuseseră admiși la Divizia de Endocrinologie și Metabolism, Spitalul Universitar Kurume din martie 2013 până în octombrie 2014. Toți participanții au acordat consimțământul scris în scris. Toate procedurile au fost conforme cu Declarația de la Helsinki, iar protocolul experimental a fost aprobat de comitetul etic al Universității Kurume (numărul studiului: 10152).

Protocol experimental

Clorhidrat de metformină (1500 mg/zi) a fost administrat fie la 23 de subiecți sănătoși, fie la 18 pacienți cu diabet zaharat de tip 2 timp de 2 săptămâni. Subiecții au început să ia metformină din doze mici, cu o creștere treptată (250 mg de două ori pe zi în prima și a doua zi, 500 mg de două ori pe zi în a 3-a și a 4-a zi, 500 mg de trei ori pe zi în a 5-a zi și după aceea). După un post peste noapte, testele de toleranță la masă (592 kcal, 75 g carbohidrați, 28,5 g grăsimi; Saraya Co., Osaka, Japonia) au fost efectuate dimineața de două ori înainte și după administrarea de 2 săptămâni de metformină. La testul de toleranță la masă, s-au recoltat probe de sânge și s-a efectuat analiza gazelor respiratorii înainte și la 1, 2, 3 ore după ingestia mesei. Aportul de energie a fost pre-specificat fiecărei baze de pacienți diabetici în funcție de înălțimea și greutatea corporală a acestora, iar cantitatea de aport real de alimente a fost verificată la fiecare masă timp de 2 săptămâni de tratament cu metformină.

Măsurători

Nivelurile de glucoză plasmatică, trigliceride serice au fost evaluate conform procedurilor standard. Concentrațiile plasmatice ale insulinei au fost măsurate cu ELISA standard. Nivelurile de lactat din sânge au fost determinate enzimatic cu teste spectrofotometrice. Volumul de oxigen consumat (VO2) și volumul de dioxid de carbon produs (VCO2) au fost măsurate cu o calorimetrie indirectă (Oxycon Alpha, Fukuda-Denshi, Tokyo, Japonia) pentru calcularea cheltuielilor de energie (EE) și a coeficientului respirator (RQ) ) conform formulei de mai jos [21].

După o perioadă de 15 minute în repaus, s-a efectuat analiza gazelor respiratorii timp de 10 sau 15 min în fiecare moment.

Studii pe animale

Animale

Șobolani Sprague-Dawley (SD) masculi (Jcl: SD, CREA Co Ltd, Osaka, Japonia) au fost utilizați în acest studiu. Animalele au fost adăpostite într-o încăpere controlată (temperatura 25 ± 2 ° C, umiditate 60 ± 10%) sub un ciclu de 12 ore lumină-întuneric (lumină la 7: 00-19: 00). Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul de experimentare animală al Universității Kurume, pe baza Ghidurilor NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (publicația NIH, 1996). Toate procedurile chirurgicale au fost efectuate sub 3% izofluran (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japonia) și s-au făcut toate eforturile pentru a minimiza suferința.

Protocol experimental

A fost efectuat un experiment preliminar pentru a măsura consumul de alimente de șobolani SD de 11 săptămâni în timpul fazei luminoase și, respectiv, a fazei întunecate. Șobolani hrăniți cu 24,2 ± 0,7 g de chow standard (10 kcal% grăsime, produs de Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, SUA: 23 cod de sursă open source D12450B) pe zi întreagă și mai mult de 90% a fost consumat în timpul întunericului fază. Astfel, am determinat 25-26g de hrănire numai în perioada întunecată pentru a diferenția clar starea de post și starea post-prandială în următoarele experimente.

Șobolanii la vârsta de 12 săptămâni (n = 24) au început să fie hrăniți numai în perioada întunecată de 12 ore pentru acomodarea cu ritmul de post și hrănire timp de o săptămână, așa cum s-a menționat mai sus. 25-26 g de chow de pelete au fost hrănite la 19:00 și retrase la 7:00 după măsurarea aportului de alimente. La vârsta de 13 săptămâni, șobolanii au fost împărțiți în două grupuri (n = 12 în fiecare grup); a primit apă potabilă fie conținând clorhidrat de metformină (2,5 mg/ml), fie nu. Toți șobolanii au fost adăpostiți individual în cuști din plastic transparent TPX® (W27 × D43 × H20 cm) cu așternut de hârtie. Greutatea corporală a fost măsurată în fiecare săptămână cu vârsta cuprinsă între 13 și 15 săptămâni. Aportul alimentar în perioada întunecată și cantitatea de băut pentru o zi întreagă au fost măsurate la 7:00 în fiecare zi.

Analiza gazelor respiratorii și a compoziției corpului

După 2 săptămâni, șobolanii cu vârsta de 15 săptămâni au fost mutați individual în camere metabolice acrilice echipate cu sistem de analiză a gazelor (sistem ARCO, Chiba) timp de două zile pentru măsurarea consumului de oxigen și a coeficientului respirator. Sistemul este format din opt camere metabolice acrilice, un spectrometru de masă (modelul ARCO-2000) și un eșantionator de gaze (modelul ARCO-2000-GS10). Fiecare cameră metabolică avea o cameră (podea de 752 cm 2 și înălțime de 20 cm), iar aerul camerei era pompat prin camere cu o rată de 2,0 L/min. Aerul din fiecare cameră a fost prelevat timp de 15 secunde. În ultimele 5 secunde, au fost măsurate concentrațiile de VO2 și VCO2, iar EE și RQ au fost calculate așa cum s-a menționat într-un studiu la om. Datele respiratorii pentru fiecare cameră au fost obținute la fiecare 5 minute, iar datele medii și cumulative pentru 12 ore în timpul perioadei de lumină sau 24 de ore au fost calculate din 144 sau 288 de probe, respectiv.

După măsurarea gazelor respiratorii, volumele de grăsime viscerală și subcutanată (mm 3) au fost măsurate folosind tomografie micro-computerizată in vivo (R_mCT2, Rigaku Co., Tokyo, Japonia) în condiții de imagistică FOV73 (φ73 mm × H57 mm), 90 Tensiunea tubului kV și curentul tubului 160 μA. Șobolanii au fost anesteziați cu 3% izofluran și au fost plasați în decubit dorsal în mașină, iar scanările seriale de 4 mm au fost efectuate de la aspectul anterior la cel posterior al celei de-a 4-a vertebre lombare. Software-ul de analiză a grăsimii (Rigaku Co., 24 Tokyo, Japonia) a estimat volumele de țesut adipos, os, aer și restul pe baza densității lor diferite de raze X și a distins țesuturile grase viscerale și subcutanate prin detectarea straturilor musculare abdominale.

Prelevarea de probe și măsurarea sângelui

După finalizarea măsurătorii antropometrice, șobolanii au fost sacrificați sub anestezie folosind 3% izofluran în stare de post (19:00) sau post-prandial (7:00), 6 șobolani în fiecare punct de timp. Probele de sânge au fost colectate prin aorta abdominală și tratate imediat așa cum este descris mai jos. Ficatul, țesutul adipos maro (BAT) și mușchiul scheletic au fost obținute și tăiate în bucăți mici și congelate imediat în azot lichid, apoi depozitate la -80 ° C.

Concentrațiile de glucoză din sânge au fost măsurate cu un glucometru portabil (One Touch Ultra; LifeScan, Milpitas, CA) imediat după prelevarea de sânge. Lactatul și piruvatul din sânge au fost determinați enzimatic cu teste spectrofotometrice. Probele de sânge rămase au fost centrifugate (3000 rpm, 10min), iar probele de ser au fost separate și depozitate la -80 ° C până la test. Concentrațiile serice de insulină au fost determinate cu un kit ELISA pentru insulină de șobolan (Shibayagi, Gunma, Japonia).

RT-PCR cantitativ în timp real

Expresiile enzimei legate de oxidarea grăsimilor, cum ar fi Acil-CoA sintază, CPT-1, Acil-CoA dehidrogenază, piruvat dehidrogenază kinază (PDK) și molecule adaptive legate de termogeneză, cum ar fi UCP-1, UCP-3, au fost măsurate în timp real cantitativ -PCR așa cum a fost descris anterior [22]. ARN a fost izolat folosind ARN-Bee (Cosmo Bio, Tokyo, Japonia), iar 5 μg de ARN total au fost transcrise invers în ADNc folosind un kit de la Invitrogen (Carlsbad, CA, SUA). PCR cantitativă în timp real pe bază de verde SYBR a șabloanelor de ADNc a fost realizată folosind StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Condițiile de ciclare PCR au fost de 10 minute la 95 ° C, urmate de 40 de cicluri de 30 sec la 95 ° C, 30 sec la 53-64 ° C și 30 sec la 72 ° C. Rezultatele au fost calculate ca expresia genei țintă în raport cu expresia genei gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (Gapdh). Exemplele de secvențe înainte și invers utilizate în acest studiu sunt prezentate în tabelul S1.

Analiza Western blot

Nivelurile de proteine ​​ale AMPKα, AMPKα fosforilat (pAMPKα), ACC, ACC fosforilat (pACC) din probele de post au fost măsurate prin analiza Western blot, așa cum sa descris anterior [20]. Țesutul hepatic a fost lizat în tampon de liză rece cu gheață conținând 1 mmol/l ditiotreitol (DTT), 0,0025% NP40 și un cocktail de inhibitori ai proteinazei. Lizatul a fost centrifugat la 19.000 g timp de 15 minute la 4 ° C și supernatantul a fost colectat ca un extract de celule întregi. Concentrația totală de proteine ​​a întregii celule a fost măsurată utilizând reactivul Bradford (Bio Rad, Hercules, CA, SUA). După ce a fost încălzit la 100 ° C timp de 5 minute, 20 μg de proteine ​​totale au fost încărcate în fiecare godeu, separate prin 7,5% SDS-PAGE (Wako, Osaka, Japonia) și transferate într-o membrană de nitroceluloză. Membrana a fost incubată cu anticorpi policlonali de iepure împotriva AMPKα, pAMPKα (Thr172), ACC, pACC (Ser79) sau anticorp monoclonal de iepure împotriva GAPDH (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA) la 4 ° C peste noapte. După ce a fost spălată, membrana a fost incubată cu IgG capră anti-iepure conjugată cu peroxidază (Wako) și apoi vizualizată utilizând un sistem ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Marea Britanie).

Test de toleranță piruvat

Într-o altă serie de experimente cu același protocol, testul de toleranță piruvat intraperitoneal a fost efectuat la șobolani SD la vârsta de 15 săptămâni cu sau fără tratament cu metformină timp de 2 săptămâni (n = 6 în fiecare grup). După 12 ore de post, o soluție de piruvat de sodiu (250 mg/ml) a fost injectată ip la o doză de 2 g/kg. Nivelurile de glucoză au fost determinate în sângele extras din coadă înainte (0 min) și 15, 30, 60, 90 și 120 min după o injecție ip piruvat.