ABSTRACT

INTRODUCERE

Nefrolitiaza (pietre la rinichi) este o afecțiune urologică comună care afectează aproximativ 10% din populație în țările industrializate (López și Hoppe, 2010; Romero și colab., 2010). În Statele Unite, prevalența bolii de calculi a crescut de la 5,2% (1994) la 8,4% (2012) (Scales și colab., 2012). La nivel global, incidența și prevalența nefrolitiazei demonstrează o tendință similară și contribuie semnificativ la dezvoltarea bolii renale cronice (CKD) (El-Zoghby și colab., 2012; Romero și colab., 2010). Povara economică a nefrolitiazei este substanțială, cheltuielile anuale raportate la 5,3 miliarde de dolari doar în Statele Unite (Kovshilovskaya și colab., 2012). În ciuda costurilor și morbidității semnificative legate de nefrolitiază, cu rate de recurență pe 5 ani care se apropie de 50% la indivizii afectați, rămâne o înțelegere completă a nefrolitiazei la nivel molecular (Katsuma și colab., 2002; Lotan și colab., 2004). Patogeneza nefrolitiazei de oxalat de calciu, cel mai frecvent subtip de piatră (80%), este multifactorială (Finkielstein, 2006). Factorii predispozanți includ tulburări metabolice, cum ar fi hipercalcurie, hiperoxalurie sau hipocitraturie, și factori de mediu, cum ar fi dieta. Aceste elemente etiologice perturbă homeostazia biochimică metastabilă a urinei, culminând în final cu depunerea cristalelor și formarea de pietre (Pak, 1998).

screening

Strategiile de prevenire a tratamentului medical pentru nefrolitiaza oxalatului de calciu, care au rămas relativ stagnante de la mijlocul anilor 1980, variază în funcție de etiologia de bază. Dovezile actuale sugerează că citratul de potasiu și diureticele tiazidice sunt agenți eficienți în prevenirea formării de pietre de oxalat de calciu în stările de hipocitraturie și hipercalcurie (Qaseem și colab., 2014; Reilly și colab., 2010). În schimb, în ​​hiperoxalurie primară și idiopatică, surse proporționale importante de formare de piatră de oxalat de calciu, dovezile sunt rare pentru un tratament medical eficient. Piridoxina a fost sugerată în trecut pe baza mai multor studii clinice mici, aleatorii (Balcke și colab., 1983; Mitwalli și colab., 1988; Rattan și colab., 1994). Abordări mai noi, cum ar fi tratamentul cu probiotice și oxalat decarboxilază, au generat rezultate mixte (Moe și colab., 2011; Xu și colab., 2013).

Progresul a fost probabil limitat din cauza lipsei unor modele preclinice adecvate care să recapituleze fiziopatologia acestei tulburări. Mai multe modele animale au fost stabilite anterior pentru studiul nefrolitiazei, inclusiv modele de șobolani, șoareci, porcine și canine (Khan, 1997). Din punct de vedere istoric, cel mai proeminent dintre acestea a fost modelul de șobolan de nefrolitiază. Modelul de șobolan se bazează pe manipularea dietei sau injecția intraperitoneală a agenților litogeni (etilen glicol, clorură de amoniu sau vitamina D3) pentru a induce formarea calculului (Khan, 1997; Liu și colab., 2007). Utilizarea acestui model a generat rezultate variabile cu formarea inconsistentă a pietrei. În plus, nefrotoxicitatea agenților litogeni are o utilitate generală limitată (Khan și Glenton, 2010; Khan și colab., 2006).

Cu această descoperire, am dezvoltat noi tehnici de imagistică pentru vizualizarea și cuantificarea sarcinii de piatră de oxalat de calciu în modelul Drosophila de nefrolitiază a oxalatului de calciu. Acest lucru a condus la dezvoltarea unei platforme funcționale de screening cu randament ridicat, permițându-ne să examinăm bibliotecile chimice pentru a identifica compuși noi care prezintă activitate antilitogenă in vivo și sunt ingerabili. Deși acest model nu recapitulează pe deplin procesele de formare a calculilor la mamifere, am identificat cu succes compuși care au fost foarte eficienți în oprirea formării calculului. Hidrochinona β-D-glucopiranozidă, cunoscută în mod obișnuit sub numele de arbutină, este un glicozid cu porțiuni de hidroxichinonă (HQ), cel mai frecvent izolat din Arctostaphylos uva-ursi sau din arbustul pitic Bearberry (Pop și colab., 2009). S-a văzut că arbutina leagă atât ionii de calciu liberi, cât și oxalatul, servind ca antagonist dublu la cristalizarea oxalatului de calciu. Această descoperire a indicat faptul că alți compuși antilitogeni noi pot fi descoperiți într-o manieră similară, datorită dezvoltării în primul rând celulare a pietrelor la rinichi.

REZULTATE

Sondele bifosfonați se leagă de calculii oxalatului de calciu format din Drosophila

Formarea calculilor oxalatului de calciu la D. melanogaster. (A) Imagini confocale și birefringențe ale cristalelor pulverizate de oxalat de calciu uman (rândul superior) și particule sintetice de hidroxiapatită (rândul inferior) colorate cu sondă alendronat-FITC. Bare de scară: 1 mm. (B) Schema modelului D. melanogaster al formării calculilor de oxalat de calciu în tubulii malpighieni (MT). (C) Imagistica intravitală a semnalului de birrefringență reprezentând calculi pe bază de oxalat în MT de larvele D. melanogaster. Imagistica intravitală a larvelor D. melanogaster induse de dietă care exprimă dietă indusă de calciu-oxalat-piatră. Săgeata indică un RFP + MT cu semnal birefringent (C, jos). Bare de scară: 1 mm. (D) MT disecate relevă prezența depozitelor pozitive (săgeți) alendronat-FITC în cadrul RFP + MT, confirmând prezența calculilor pe bază de oxalat. Barele de scalare: 25 µm. (E) MT disecate așa cum sunt imaginate prin câmp luminos sau microscopie electronică cu scanare (SEM). Săgeata întreruptă reprezintă complexul tubular și intestinal al malpighianului. Săgeata solidă arată un calcul MT. (F) Analiza cu raze X SEM/dispersivă a energiei (EDX) a calculilor oxalat de calciu monohidrat extrasa din MT. Bara de scalare: 3 µm. (G) Analiza SEM/EDX a calculilor de deshidrat de oxalat de calciu extrasa din MT. Bara de scalare: 3 µm.

D. excreții fecale pozitive pentru birrefringență melanogaster ca metodă de screening de mare viteză pentru agenții antilitogeni

Calculii pe bază de oxalat se găsesc în MT în plus față de intestinul posterior al muștei. Creșterea concentrațiilor de oxalat de sodiu adăugate la mediul de zbor standard a dus la o creștere proporțională a sarcinii cu pietre în MT. Semnalul de birrefringență (cristale) și colorarea cu alendronat-FITC (oxalat de calciu) au fost utilizate la sarcina cantitativă de piatră/cristal (Fig. 2A). Creșterea concentrației de oxalat de sodiu a avut, totuși, un impact asupra supraviețuirii muștelor în timp (Fig. 2B); prin urmare, o concentrație de 0,5% g/v de oxalat de sodiu a fost utilizată în toate experimentele ulterioare. Un test de excreție fecală a fost dezvoltat pentru a cuantifica schimbările în sarcina pietrei prin inserarea unei lamele de acoperire în capacul de burete al tuburilor cu muște în timpul incubației. D. melanogaster a răspuns prin depunerea pasivă de excreții fecale bogate în calculi pe lamă (Fig. 2C, stânga și mijloc), care a fost apoi supusă microscopiei cu lumină polarizată pentru semnalul de birrefringență reprezentând cristale/calculi. Examinarea unei singure picături fecale a relevat autofluorescență cu corpuri minerale foarte birefringente în depozitul fecal. Niciun astfel de semnal birefringent nu a fost observat în depozitele fecale cu o dietă standard (Fig. 2C, dreapta).

Calculi prezenți în excrețiile fecale ale Drosophila ca platformă de descoperire a medicamentelor. (A) Creșterea cantităților de oxalat de sodiu în formarea de pietre la rinichi indusă de mediu zburător, prezentă în MT, evidențiată de semnalul de birrefringență și semnalul alendronat-FITC. (B) Supraviețuirea D. melanogaster pe mediu de zbor tratat cu oxalat de sodiu pe o perioadă de 60 de zile. (C) D. melanogaster depune excremente fecale bogate în calculi pe peretele tubului cu muște (verde, autofluorescență a materiei fecale) și acoperiș fixat pe capacul buretelui. Muștele crescute în mediu cu mușchi bogat în oxalat de sodiu produc corpuri birefringente care conțin excremente fecale reprezentând calculi (semnal alb, birefringență).

Rezultatele screeningului medicamentelor folosind excremente fecale și calculi prezenți în excrețiile fecale din coloniile D. melanogaster. (A) Schema ecranelor de bibliotecă de medicamente in vivo pentru compuși antilitogeni pe baza testului cu lamă de acoperire a excretelor fecale. (B) Imagini reprezentative ale calculilor sau densității excretelor bazate pe o scară arbitrară de la 10 (cel mai mare/cel mai dens) la 1 (cel mai mic). Este afișat un control al vehiculului DMSO cu un scor de 10 pentru calcule. Este afișat un „hit” reprezentativ cu un scor 1 pentru calcule. Bare de scară: 4 mm. (C) Rezultatul screeningului medicamentelor rezultă dintr-o bibliotecă chimică care reprezintă 360 de compuși naturali. „Hits” au fost definite ca lamele de acoperire care au dat un scor „1” pentru depunerea calculilor, fără impact toxic asupra viabilității D. melanogaster (5-10 în ceea ce privește scorul de excreții fecale, poarta verde). (D, E) Un al doilea ecran de bibliotecă focalizat cu cele opt accesări (D) a dat o listă finală cu doi compuși activi (E). După analiza terțiară a celor doi compuși activi, unul a fost validat, arbutin.

Arbutina este un agent antilitogen eficient

Arbutin este un glicozid cu un lanț lateral de hidroxichinonă, fără rapoarte anterioare privind interacțiunile cu oxalat sau calciu. Atunci când este suplimentat pentru a zbura mediu + 0,05% oxalat de sodiu, arbutina la 1 mM a dus la o aproape abrogare a depozitelor de calcul în MT disecate în comparație cu martorii (mediu de zbor + 0,5% oxalat ± DMSO) (Fig. 4A, B) Conținutul calculat depus în excrețiile fecale a scăzut semnificativ la> 64 µM arbutină (Fig. 4C) cu o concentrație inhibitorie semimaximală calculată (IC50) de 40 µM. Scăderile observate ale conținutului de calculi în excrețiile fecale au corespuns scăderilor conținutului de calculi în MT (Fig. 4D, 32 µM și 512 µM tratament cu arbutină).

Arbutina și interacțiunile sale cu calciu și oxalat. (A) Imaginea SEM a arbutinei complexată cu calciu. Spectrele EDX dezvăluie patru ioni de calciu pentru fiecare moleculă de oxalat. (B) Analiza calorimetrică de titrare izotermă a arbutinei și a clorurii de calciu, relevând un raport molar de patru ioni de calciu pentru fiecare moleculă de arbutină. (C) Spectrul de desorbție/ionizare cu laser asistat de matrice (MALDI) a complexelor de calciu și arbutină formate în soluție. (D) Spectrul MALDI al complexelor de arbutină și oxalat format în soluție.

Arbutina se leagă de suprafața nanocristalelor pe bază de oxalat

Au fost formate cristale mari de oxalat de sodiu pentru microscopie de birrefringență confocală pentru a determina dacă arbutina se leagă direct de suprafața calculilor. Calculele de oxalat de sodiu realizate în acest mod au relevat suprafețe poligonale și netede pe cristale pe bază de oxalat (Fig. 6A, stânga). Incubația cu arbutină a dus la aberații ale suprafeței cristalului (Fig. 6A, dreapta). Pentru a confirma că arbutinul se leagă de suprafața cristalelor pe bază de oxalat, microscopia cu forță atomică (AFM) a fost efectuată pe ambele tipuri de cristale, cu cristale numai cu oxalat care dezvăluie o suprafață netedă și neîntreruptă conform analizei rugozității liniei de scanare (Fig. 6B). Cristalele de oxalat tratate cu arbutină au dezvăluit o topografie a cristalului foarte activă (Fig. 6C, săgeți roșii), cu un indice de rugozitate mai mare decât în ​​cristalul netratat. Cristalele pe bază de oxalat au fost, de asemenea, semnificativ mai mici decât cristalele netratate, pe baza analizei volumetrice AFM (Fig. 6B, C).

Analiza interacțiunii oxalatului de calciu și a structurii cristaline de arbutină. (A) Imagini de birrefringență confocale ale cristalelor de oxalat pur înainte de expunerea la arbutină (stânga) și după expunerea la arbutină (dreapta). Barele la scară: 10 µm. (B) Imagine de microscopie cu forță atomică (AFM) a cristalelor de oxalat pur. Plăcile din panoul din mijloc oferă vederi de mărire mai mari ale suprafeței cristalului. Analiza liniei de scanare a canalului de înălțime din inserție relevă o topografie netedă. (C) Cristalele de oxalat expuse la arbutină dezvăluie o topografie de suprafață extrem de activă decorată cu molecule de medicament arbutină (săgeți roșii). Inserțiile din panoul din stânga dezvăluie o topografie a suprafeței aspre, după cum se arată în analiza liniei de scanare a canalului de înălțime.

Arbutin inhibă toxicitatea pe bază de oxalat in vitro

Celulele epiteliale ale rinichilor embrionari umani (HEK) crescute in vitro incubate în oxalat de sodiu 20 μM au fost asociate cu rate de viabilitate celulare semnificativ mai mici decât cele crescute în condiții de control, cu unele nanocristale observate în celule în perioada de incubație (Fig. 7A). Cu toate acestea, pe lângă arbutină (1 mM final) în mediu ameliorat acest efect, fără niciun impact asupra viabilității celulare sau asupra activității lactatului dehidrogenazei (LDH) comparativ cu tratamentul cu arbutină singur (Fig. 7B, C). În aceste celule nu a fost observat niciun semnal birefringent.

Citotoxicitatea celulelor HEK293 în mediu oxalat de sodiu cu sau fără arbutină a fost determinată prin cuantificarea conținutului de lactoză dehidrogenază eliberat de celulele deteriorate folosind un kit de detectare a citotoxicității PLUS (LDH) (Roche), urmând instrucțiunile producătorului. Citirile absorbantei au fost efectuate la 492 nm folosind un spectrofotometru de microplacă BioTek PowerWave HT.

Mulțumiri

Mulțumim doctorilor Anthony Percival Smith și Brent Sinclair de la Departamentul de Biologie, Universitatea de Vest pentru furnizarea stocurilor de muște utilizate în experimentele noastre, și dr. Julian Dow de la Universitatea din Glasgow pentru furnizarea de șoferi GAL4. Stocurile obținute de la BDSC (NIH P40OD018537) au fost utilizate în acest studiu. Recunoaștem Carson Gavin pentru asistență în imagini inversate și confocale. H.S.L. mulțumesc dr. Balaji Iyengar pentru îndrumare și direcție în acest proiect.

Note de subsol

Interese concurente

Autorii nu declară interese concurente sau financiare.