Abstract

Furnicile care cultivă ciuperci se angajează în asociații mutualiste atât cu ciuperca pe care o cultivă pentru hrană, cât și cu actinobacteriile (Pseudonocardia spp.) care produc antibiotice selective pentru a apăra acea ciupercă de paraziții fungici specializați. Am analizat un astfel de sistem la nivel molecular și am constatat că bacteria asociată cu furnica Apterostigma dentigerum produce dentigerumicină, o depsipeptidă ciclică cu aminoacizi foarte modificați, pentru a inhiba selectiv ciuperca parazitară asociată (Escovopsis sp.).

Am început prin izolarea bacteriei (Pseudonocardia sp.), cultivarul fungic și ciuperca parazităEscovopsis sp.) de la o furnică (Apterostigma dentigerum) cuib colectat în Gamboa, Panama în 2001 (codul coloniei CC011120-4, vezi Metode suplimentare online; Fig. 1a). Pseudonocardia tulpina izolată din cuticula A. dentigerum inhibă puternic Escovopsis izolat obținut din aceeași colonie (Fig. 1b), în timp ce cultivarul fungic este relativ rezistent la tulpina bacteriană (Fig. 1 suplimentară online). Analiza inițială LC/MS atât a unui extract de acetat de etil dintr-o cultură lichidă întreagă, cât și a unui extract de metanol dintr-o cultură de placă de agar din Pseudonocardia tulpina a dezvăluit prezența unei singure componente majore (Fig. suplimentară 2 online). O investigație ulterioară, care implică cultivarea la scară largă (8 l) și fracționarea ghidată de testare prin coloană flash C18 și HPLC, au confirmat că acest compus major, pe care l-am numit dentigerumicină (1, FIG. 2a), este responsabil pentru Escovopsis inhibitie.

simbioze

(A) Apterostigma furnică cultivatoare de ciuperci (codul coloniei CC011120-4), care arată un lucrător al Apterostigma dentigerum. (b) Demonstrarea bio-testului în perechi demonstrează in vitro inhibarea ciupercii parazitare Escovopsis (sus și jos) de Pseudonocardia (centru) (placa de agar cu diametrul de 8,5 cm).

(A) Structura dentigerumicinei (1) conține unități de aminoacizi foarte modificate, cum ar fi acizii piperazici. (b) Curba susceptibilitate doză-răspuns reprezentând concentrația logaritmică a dentigerumicinei în μM față de densitatea celulară fungică (unitate de fluorescență) a Escovopsis, demonstrând inhibarea ciupercii parazitare de către dentigerumicină cu un MIC de 2,8 μM. Barele de erori arată s.d.

Dentigerumicina a fost izolată sub formă de pulbere albă având formula moleculară C40H67N9O13, determinată prin spectrometrie de masă ESI-TOF de înaltă rezoluție cuplată cu date spectrale 1H și 13C RMN (Tabel suplimentar 1 și Fig. Suplimentar 3 online). Spectrul 1 H RMN a afișat 1 proton singlet în jos la 9,50 p.p.m., 2 protoni dublet amidă și 12 protoni între 4 și 6 p.p.m. Spectrele RMN 13 C și gHSQC au arătat 7 carboni amilici sau ester carbonilici, 5 carboni purtători de oxigen, 9 carboni purtători de azot și 19 semnale carbon alifatice. Analiza datelor spectrale gHSQC a permis atribuirea tuturor corelațiilor cu o legătură de carbon și protoni și a identificat nouă protoni atașați la heteroatomi.

Interpretarea spectrelor RMN gCOSY, TOCSY, gHSQC și gHMBC atribuite șase substructuri derivate din aminoacizi și o substructură derivată din polichide. Acestea includ două unități de acid piperazic (Pip-1 și Pip-2), acid γ-hidroxipiperazic (γ-OH-Pip), β-hidroxileucină (β-OH-Leu), N-hidroxialanină (N-OH-Ala), alanină și un lanț lateral acil purtător de piran (Fig. 2a și Fig. Suplimentară 4a online). Corelațiile cheie HMBC au asigurat secvența unităților de aminoacizi și lanțul lateral acil (Fig. Suplimentară 4b), care a completat structura plană a dentigerumicinei (Fig. 2a). Am determinat stereochimia dentigerumicinei folosind o combinație de analize spectroscopice, reacții degradative și derivatizări, așa cum se arată mai jos. Configurația relativă a inelului piranic în lanțul lateral acil a fost determinată de corelații ROESY (Fig. Suplimentară 5a online). Configurația relativă a celor două centre stereogene consecutive în β-OH-Leu a fost stabilită ca 23S * și 24S * de .-analiza configurației bazate pe 8 (Fig. suplimentară 5b). Configurația relativă a acidului γ-hidroxipiperazic a fost determinată ca (5S *, 7S *) -γ-OH-Pip prin constanta de cuplare 1 H- 1 H și analiza spectrală ROESY 9 (Fig. suplimentară 5c).

Pentru că gratuit N-OH-Ala nu era de așteptat să reacționeze cu FDLA, am convertit N-OH la N-H prin tratamentul dentigerumicinei cu TiCl3 (vezi Metode suplimentare) 14. Am confirmat această conversie cu 1 H, gCOSY, TOCSY, gHSQC și gHMBC RMN (Fig. Suplimentară 3) a produsului de reducere (8) și prin analiza spectrală de masă de înaltă rezoluție (Tabelul suplimentar 2 online). Produsul (8) a fost apoi hidrolizat, derivatizat cu L-FDLA și analizat cu LC/MS așa cum s-a descris anterior pentru a stabili un 15S configurare.

Am determinat configurația absolută a lanțului lateral acil prin intermediul analizei spectrale CD a unui complex Mo2 (OAc) 4 al 1,2-diolului la C29 și C30 (vezi Metode suplimentare). Pe baza regulii empirice 15, complexul dentigerumicinei, care are un semn negativ în spectrul CD indus, ar trebui să aibă 29S și 30R configurații dacă porțiunea 1,2-diol adoptă conformația sa prevăzută cu energie scăzută (Fig. suplimentară 7 online). Acest rezultat a stabilit, de asemenea, 33S și 34R configurații bazate pe stereochimia lor relativă determinată anterior.

Derivațiile chimice ale acizilor piperazici au fost deosebit de provocatoare 9, iar configurațiile lor absolute au fost stabilite în principal prin cristalografie cu raze X. Combinația de hidroliză rapidă, Marfey avansat și metode Mosher modificate oferă o abordare general aplicabilă pentru caracterizarea acestor aminoacizi din ce în ce mai întâlniți.

Dentigerumicina este o depsipeptidă nedeclarată anterior care conține aminoacizi neobișnuiți - acid piperazic, acid γ-hidroxipiperazic, β-hidroxileucină și N-hidroxialanină - împreună cu un lanț lateral derivat din polichide care conține un inel piranic. Produsele naturale cele mai asemănătoare cu dentigerumicina sunt polioxipeptinele 16 și aurantimicinele 17, care au câțiva aminoacizi în comun cu dentigerumicina. Cu toate acestea, ele nu au aceeași structură de bază ca dentigerumicina, deoarece ceilalți aminoacizi diferă - cel mai important printr-o unitate suplimentară de acid piperazic în dentigerumicină, care se așteaptă să producă o conformație a nucleului foarte diferită. Pentru că toate acestea erau izolate de Streptomyces spp., este probabil ca unele elemente biosintetice să fi fost împărtășite 18 .

În timp ce testele din placa Petri arată că dentigerumicina inhibă în mod clar ciuperca parazitară mai mult decât ciuperca cultivată (Fig. 8 suplimentară online), am evaluat concentrația sa minimă inhibitoare (MIC = 2,8 μM) cantitativ într-un test de cultură lichidă împotriva Escovopsis parazit din colonia CC011120-4 (Fig. 2b). Un test de cultură lichidă nu a fost potrivit pentru ciuperca cultivată, deoarece crește extrem de lent în cultura lichidă. Dentigerumicina, de asemenea, inhibată Candida albicans Genul mai sălbatic, C. albicans ATCC10231 și rezistent la amfotericină C. albicans ATCC200955 cu valori MIC de 1,1 μM. Aceste rezultate sugerează că în Apterostigma simbioză, ca și în sistemul sudic al gândacului de pin mediat de micangimicină 2,19, ascomicetul (Escovopsis sp.) este sensibil în timp ce bazidiomicetul (cultivar) este rezistent.

Notă: Informatie suplimentara și informațiile despre compușii chimici sunt disponibile pe site-ul web Nature Chemical Biology.