• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: liuy @ sibs.ac.cnjdhan @ genetics.ac.cn

Editat de Valter D. Longo, Universitatea din California de Sud, Los Angeles, CA și acceptat de Comitetul Editorial 20 martie 2012 (primit pentru revizuire 23 noiembrie 2011)

medii

Abstract

Intervențiile dietetice sunt modalități eficiente de prelungire sau scurtare a duratei de viață. Prin examinarea expresiilor genice hepatice de vârstă mijlocie la șoareci în diferite condiții dietetice, care au dus la durate de viață diferite și la fenotipuri legate de îmbătrânire, am fost capabili să identificăm gene și căi care modulează procesul de îmbătrânire. Am constatat că căile corelate transcripțional cu durata de viață modulată în dietă și modificările fiziologice au fost îmbogățite pentru gene care modifică durata de viață. În mod curios, expresia genei mitocondriale corelată cu durata de viață și anticorelată cu modificările patologice legate de îmbătrânire, în timp ce expresia genei peroxizomale a arătat o tendință opusă. Ambele organite produc specii reactive de oxigen, un factor cauzal propus pentru îmbătrânire. Această constatare implică o contribuție a peroxizomului la îmbătrânire. În concordanță cu această ipoteză, scăderea nivelului de expresie a genelor de proliferare a peroxizomilor a scăzut nivelurile de peroxid celular și a extins durata de viață a Drosophila melanogaster și Caenorhabditis elegans. Aceste descoperiri arată că modificările transcripționale rezultate din intervențiile dietetice pot reflecta în mod eficient factorii cauzali ai îmbătrânirii și pot identifica căile de longevitate necunoscute anterior sau subapreciate, cum ar fi calea peroxizomului.

Expresiile genelor legate de îmbătrânire au fost examinate prin analiza microarray pentru diferite țesuturi umane și de șoareci (1 ⇓ ⇓ 5-5), muște de fructe (6) și viermi (7, 8). Aceste studii au dezvăluit sute până la mii de gene și numeroase funcții biologice care se schimbă pe măsură ce un organism îmbătrânește. Unele dintre modificări sunt similare între diferite specii. Expresiile genelor implicate în răspunsul la stres și inflamație cresc în mod constant la animale, iar acele expresii implicate în funcțiile specifice țesuturilor scad treptat, reflectând declinul funcțional al țesuturilor sau organelor (9). Cu toate acestea, majoritatea acestor schimbări reflectă consecința îmbătrânirii (unele pot servi ca biomarkeri ai îmbătrânirii), mai degrabă decât cauza sau factorii de reglementare ai îmbătrânirii. De exemplu, genele cheie de reglare a îmbătrânirii identificate prin abordări genetice sunt rareori identificabile doar prin modificările nivelului de expresie în timpul îmbătrânirii (10). Cu toate acestea, intervențiile procesului de îmbătrânire prin măsuri genetice, dietetice sau reproductive pot modula în mod eficient durata de viață și îmbătrânirea (11, 12).

Restricția calorică (CR) este cea mai bine studiată intervenție pentru modularea îmbătrânirii și s-a raportat că prelungește durata de viață medie și maximă în majoritatea organismelor examinate (11, 12). În schimb, hrănirea șoarecilor cu o dietă bogată în grăsimi și bogată în calorii are ca rezultat obezitate legată de vârstă, boli cardiovasculare și alte tulburări metabolice și scurtează durata de viață (13 ⇓ –15). Cu toate acestea, exercițiile fizice pot crește cheltuielile de energie, pot reduce greutatea corporală și pot preveni anumite scăderi funcționale legate de vârstă (16). Prin urmare, nu este surprinzător faptul că căile de detectare a nutrienților și a energiei au fost identificate prin abordări genetice pentru a fi regulatori cheie ai duratei vieții și a îmbătrânirii (12, 17).

În acest context, am întrebat mai întâi dacă cele șase grupuri dietetice diferite dau naștere unor durate de viață diferite în funcție de nivelurile de intrare și de ieșire a energiei; dacă da, am întrebat dacă putem prezice diferențele de durată de viață între aceste grupuri de la fenotipurile hepatice de vârstă medie și expresiile genice hepatice și, în cele din urmă, dacă genele sau căile care prezic diferențele de durată de viață sunt regulatori ai duratei de viață. Faptul că toate experimentele de intervenție au fost efectuate în paralel, mai degrabă decât în ​​diferite laboratoare cu condiții variabile și/sau necomparabile, ne-a permis să realizăm o analiză integrativă care să nu conțină variații ale sistemului în date; am căutat gene țintă comune ale diferitelor intervenții dietetice care contribuie la consecințele diferențelor de durată de viață prin modificări ale nivelurilor lor de expresie genetică. Rezultatele noastre indică faptul că expresiile genei ficatului de vârstă mijlocie care prezintă o corelație pozitivă sau negativă cu durata medie de viață a celor șase grupuri au identificat într-adevăr nu numai multe gene implicate anterior în îmbătrânire, ci cel puțin o cale anterioară necunoscută sau subapreciată legată de îmbătrânire, care implică biogeneza peroxizomală ca o determinant cheie al longevității.

Rezultate

Durata de viață și fenotipurile metabolice ale șoarecilor sub diferite regimuri de intervenție.

Sănătatea ficatului la vârsta mijlocie la șoareci sub diferite regimuri de intervenție.

Motivând faptul că ficatul este esențial pentru homeostazia metabolică și poate servi ca un indicator funcțional al organelor pentru sănătatea întregului corp, am decis să examinăm dacă patologia ficatului la vârsta mijlocie sub diferite regimuri de intervenție se corelează cu fenotipul duratei de viață. În jurul vârstei de vârstă mijlocie de 62 de săptămâni, șoarecii din grupul HF aveau ficat mărit, cu o creștere dublă a greutății ficatului față de grupul LF, în timp ce CR antagoniza mai puternic hepatomegalia indusă de HF decât Ex (Anexa SI, Tabelul S1). Apoi, am evaluat funcția hepatică prin măsurarea nivelurilor serice de alanină aminotransferază (ALT) și aspartat aminotransferază (AST), markerii bine stabili ai leziunilor sau leziunilor hepatice. În grupul HF al șoarecilor, nivelurile serice de ALT sau AST au fost semnificativ crescute și, în schimb, ambele au fost semnificativ mai mici în grupurile HF + CR și HF + Ex (anexa SI, fig. S3A), sugerând reduceri ale hepatocelularului asociat cu HF daune cauzate de CR și Ex. Din nou, CR a avut un efect mai pronunțat de inversare a acestei consecințe a alimentării cu HF decât Ex (Anexa SI, Fig. S3A).

În mod consecvent, CR a prevenit complet supraîncărcarea hepatică a trigliceridelor indusă de HF (TG; adică hepatosteatoză) și a redus considerabil conținutul de colesterol hepatic în grupul HF + CR, reducând în același timp acumularea de TG hepatică în grupul LF-CR (apendicele SI, tabelul S1 și Fig. S3B). Deoarece leziunile cronice ale ficatului induse de ficatul gras nealcoolic pot duce la fibroză hepatică, ne-am întrebat dacă CR sau Ex ar putea exercita un efect asupra acestui proces. Evaluarea prin colorarea Sirius Red a depunerii fibrotice de colagen a arătat că aproximativ 12% din ficatul din grupul HF au fost Sirius Red-pozitiv, reprezentând o creștere de aproape 10 ori față de grupul LF care a prezentat niveluri foarte scăzute de fibroză (SI Anexa, Fig. S3C). Atât CR, cât și Ex ar putea reduce semnificativ fibroza hepatică indusă de HF de la ± 12% la ± 2%, ceea ce a fost comparabil cu nivelul grupului LF al șoarecilor (Anexa SI, Fig. S3C).

Se știe că perturbațiile funcției mitocondriale contribuie la disfuncțiile metabolice și pot juca un rol cauzal în procesul de îmbătrânire. În conformitate cu această noțiune, șoarecii din grupul HF au prezentat o reducere de ~ 50% a densității mitocondriale în hepatocite în raport cu grupul LF, dar fără diferențe aparente în mărimea lor (Anexa SI, Fig. S3D). CR a crescut densitatea mitocondrială la ficat de la animale hrănite cu HF, dar nu cu LF, în timp ce Ex nu a prezentat niciun efect detectabil indiferent de diete (SI Anexa, Fig. S3D). În mod special, atât CR, cât și Ex au crescut dimensiunea mitocondrială în ambele diete, CR provocând un efect mai mare. Prin urmare, CR ar putea crește atât densitatea, cât și dimensiunea mitocondriilor la ficatul șoarecilor hrăniți cu HF (Anexa SI, Fig. S3D).

Corelarea fenotipurilor metabolice ale vârstei medii cu durata de viață.

Luate împreună, fenotipurile fizice și fiziologice rezultate atât la nivelurile organelor cât și ale organelor hepatice au fost foarte coordonate în cadrul celor șase scheme de intervenție, care ar putea fi grupate în trei grupuri majore (Fig. 2). Cel mai mare grup a reflectat stările patologice ale vârstei mijlocii ale ficatului și ale altor parametri asociați cu serul și întregul corp, cum ar fi colesterolul seric, greutatea corporală și conținutul de grăsime, care este corelat pozitiv cu aportul de energie (Fig. 2). Al doilea grup, o jumătate din dimensiunea grupului menționat anterior, a constat din dimensiunea și densitatea mitocondriilor, activitatea în timpul ciclului luminii și alți parametri de performanță la animalele în vârstă (de exemplu, coarda de coadă, rotarodul și creșterea părului), care pozitiv corelat cu durata de viață (Fig. 2). Valorile medii ale scorului z din aceste două grupuri au fost puternic corelate negativ [coeficientul mediu de corelație Pearson (PCC) = -0,97]. În cele din urmă, grupat slab cu al doilea grup, cel de-al treilea și cel mai mic grup a inclus cheltuieli și activitate de energie în timpul ciclului întunecat, care nu a arătat o corelație puternică cu durata de viață (Fig. 2).

Parametrii fiziologici ai vieții medii corelați cu durata de viață. Gruparea ierarhică a grupurilor de intervenție a dietei și parametrii fiziologici indicați, inclusiv greutatea corporală, conținutul de grăsime, măsurătorile hepatice și serice ale vârstei medii, consumul și cheltuielile de energie și markerii sensibili la îmbătrânire, pe baza valorilor medii ale grupului, precum și a duratei de viață.

Profiluri de expresie a genei hepatice de vârstă mijlocie în cadrul diferitelor scheme de intervenție.

Pentru a testa experimental dacă biogeneza peroxizomului afectează negativ durata de viață, am folosit doi mutanți Drosophila melanogaster pex1 S4868 și pex13 KG04339 care adăpostesc mutații în regiunile promotor de pex1 și pex13 care au dus la scăderea nivelurilor de expresie ale acestor gene (Fig. 4C, Inset). În comparație cu tulpinile WT, ambii mutanți au avut o durată de viață care a crescut cu 16% la muștele masculine și cu 13% la muștele femele (Fig. 4C).

Eliminarea genelor Peroxisomale duce la scăderea nivelului de peroxid celular și creșterea toleranței la stresul oxidativ.

Apoi am întrebat dacă eliminarea RNAi a genelor PEX a dus la reducerea peroxidului la animale sau a crescut toleranța animalelor la peroxid. În comparație cu muștele parentale WT, atât mutanții homoxigoti pex1, cât și pex13 (pex1 S4868 și pex13 KG04339) au avut niveluri reduse de peroxid de hidrogen (Fig. 5A), care este principalul produs metabolic final din peroxizomi. Reducerea a fost mai puternică la bărbați decât la femei. Mutanții pex13 au prezentat o reducere mai substanțială a peroxidului decât mutanții pex1 pentru ambele sexe, dar mai ales pentru bărbați (Fig. 5A). Această constatare este în concordanță cu extinderea relativ mai lungă a duratei de viață la bărbații pex13 (Fig. 4C). În C. elegans, comparativ cu martorul vectorial, eliminarea RNAi a prx-5, prx-11, prx-13 sau F18F11.1 a scăzut nivelurile endogene ale speciilor oxidative reactive (ROS) (Fig. 5B) și a crescut stresul toleranță la paraquat (Fig. 5C). În schimb, eliminarea genelor PEX nu a crescut în mod constant rezistența la șoc termic (anexa SI, fig. S10B).

Acum, că pot fi efectuate în mod obișnuit experimente la scară largă la nivelul genomului, modul de proiectare a unui experiment de biologie a sistemelor pentru a surprinde în mod eficient căile de reglementare critice pentru îmbătrânire și durata de viață este o problemă stringentă. În acest studiu, am arătat că, în concordanță cu faptul că intervenția dietetică este o abordare puternică pentru modularea îmbătrânirii și a duratei de viață în aproape toate organismele studiate, analiza modificărilor expresiei genelor ca răspuns la intervențiile dietetice este o modalitate eficientă de a identifica modulatorii de îmbătrânire și durata vieții . Folosind o astfel de paradigmă de proiectare, experimente suplimentare cu mai multe condiții dietetice și/sau măsurători la nivelul indivizilor pot ajuta la elucidarea rețelelor complexe de îmbătrânire și control al duratei de viață în diferite condiții nutriționale. O astfel de abordare oferă, de asemenea, potențialul de a defini mecanisme care stau la baza variațiilor individuale ca răspuns la condițiile de mediu/dietetice și poate oferi o cale de a dezvolta regimuri dietetice personalizate pentru a optimiza perioada de sănătate.

Materiale și metode

Unele dintre procedurile și materialele experimentale pentru studii pe animale și analize bioinformatice sunt descrise în anexa SI.

Intervenții dietetice la șoareci.

Determinarea duratei de viață la șoareci.

După ce opt șoareci au fost selectați aleatoriu din fiecare grup pentru analize ale fenotipurilor metabolice ale vârstei mijlocii la vârsta de 62 săptămâni, supraviețuirea a fost evaluată de la animalele rămase (n = 22 per grup), care au fost sub supraveghere atentă zilnic pentru înregistrarea morții. Curbele de supraviețuire au fost reprezentate grafic folosind metoda Kaplan-Meier, iar diferențele de viață între grupuri au fost evaluate prin testul log-rank. Durata de viață maximă a fost calculată ca vârsta medie a celor mai vechi 20% dintre șoareci din fiecare grup.

Analize statistice.

Toate datele fiziologice pentru studiile de intervenție pe animale au fost prezentate ca medii ± SEM și analizate prin ANOVA cu două căi. Diferențele au fost considerate semnificative statistic atunci când mutanții P S4868 și pex13 KG04339 (42) au fost obținuți de la Bloomington Stock Center și s-au încrucișat de șase ori pentru a elimina diferențele de fond. Muștele au fost crescute pe făină standard de porumb la 25 ° C. Atât bărbații, cât și femelele au fost colectate în decurs de 24 de ore de la eclosie și alocate aleatoriu flacoanelor de sticlă la o densitate de 20 de muște pe flacon și 10 flacoane pe genotip (n = 200). Muștele au fost transferate în flacoane proaspete la fiecare 3 zile și s-a înregistrat numărul de morți.

Măsurarea nivelului H2O2.

pex1 S4868, pex13 KG04339 și w 1118 muște (42) au fost cultivate pe făină standard de porumb la 25 ° C. Bărbații și femelele adulte au fost separați la 1 zi după eclosie. La 7-8 zile după eclosiune, muștele mascul și femela din fiecare genotip au fost împărțite în patru grupuri cu câte 10 muște în fiecare grup. Muștele din fiecare grup au fost apoi omogenizate împreună, iar nivelul H2O2 a fost determinat folosind un kit de detectare de la Beyotime (S0038) urmând instrucțiunile producătorului.

C. elegans Tulpini și ARNi.

Tulpinile C. elegans au fost menținute la 20 ° C așa cum este descris (43), cu excepția cazului în care se menționează altfel. Tulpinile de viermi N2, daf-2 (e1370) și daf-16 (mu86) au fost obținute de la Centrul Genetic Caenorhabditis. RNAi s-a efectuat în esență așa cum s-a descris anterior (10, 44) cu biblioteca de hrănire RNAi a Ahringer (45).

C. elegans Analiza duratei de viață.

Durata de viață a tulpinilor de C. elegans a fost determinată așa cum s-a descris anterior (10) cu modificări minore. Pe scurt, viermii au fost cultivați la 20 ° C timp de două sau mai multe generații în plăcile standard de mediu de creștere a nematodelor (NGM) cu E. coli OP50 înainte de teste. Viermii adulți la începutul depunerii ouălor (ziua 0) au fost transferați pe plăcile standard RNAi NGM cu bacterii RNAi. Cel puțin 100 de viermi gravizi pe tratament în trei plăci au fost mutați pe plăci proaspete la fiecare 2-3 zile. Viermii care au fost împachetați, explodați sau târâți de pe farfurie au fost excluși din analiză. Semnificația curbelor de supraviețuire a fost calculată prin testul log-rank folosind pachetul Survival în R (http://www.r-project.org/).

Măsurarea nivelului endogen de ROS.

Nivelul endogen al ROS în C. elegans a fost măsurat folosind diacetat de 2 ′, 7′-diclorofluorescină (DCF-DA, D6883; Sigma) așa cum s-a descris anterior (46) cu modificări. Aproximativ 1.000 de viermi adulți (ziua 4) au fost colectați în tampon M9 și spălați de mai mult de trei ori pentru a elimina bacteriile. Apoi, viermii au fost spălați o dată în PBS, transferați într-un tub de 1,5 ml și congelați imediat în azot lichid. După decongelare la temperatura camerei, viermii au fost rupți prin sonicare (Misonix). Supernatantele au fost colectate după centrifugare (rotor Eppendorf F-45-24-11; 12.000 rpm la 4 ° C timp de 5 minute) și transferate în tuburi noi. Supernatantul conținând 5 μg proteină a fost incubat cu 10 μL 100 μM DCF-DA în PBS la temperatura camerei timp de 10 minute înainte de centrifugare. Intensitatea fluorescenței supernatantului amestecului a fost măsurată folosind un Agilent Stratagene MX3000P în intervalul de detecție standard pentru SYBR Green. Au fost efectuate șase măsurători pentru fiecare probă la intervale de 5 min pentru a examina liniaritatea semnalului de fluorescență DCF-DA așa cum s-a descris anterior (46). Nivelul ROS a fost determinat de intensitatea fluorescenței la ultimul moment de timp după scăderea fluorescenței de fond detectată fără supernatant.

Testele de rezistență la stres oxidativ.

Aproximativ 200 de viermi adulți (ziua 4) pe grup de bacterii ARNi hrănite au fost colectate în 300 μL tampon M9 și spălate de mai mult de trei ori. Aproximativ 50 de viermi au fost transferați pe plăcile cu 24 de godeuri cu 500 μL paraquat 0,4 M (Sigma) în M9 per godeu. Supraviețuirea a fost determinată după 8 ore de tratament.

Mulțumiri

Îi mulțumim prof. Hong Zhang de la Institutul Național pentru Științe Biologice și Dangsheng Li de la Cell Research pentru sugestii neprețuite. De asemenea, mulțumim lui Christopher B. Newgard (Universitatea Duke) pentru proiectarea inițială a studiului de intervenție la șoareci. Această lucrare a fost susținută de subvențiile chineze Ministerul Științei și Tehnologiei 2011CB910900 (către Y.L.), 2011CB504206 (către J.-D.J.H.) și 973 Program 2012CB524900; National National Science Foundation of China Grants 81021002 (către Y.L.), 30988002 (către Y.L.), 30830033 (către Y.L.), 30890033 (către J.-D.J.H.) și 91019019 (către J.-D.J.H.); și Granturile Academiei Chineze de Științe KSCX2-EW-R-09 (către YL), KSCX2-EW-R-02 (către J.-DJH), KSCX2-EW-J-15 (către J.-DJH) și XDA01010303 (către J.-DJH). M.K. este o Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging.

Note de subsol

↵ 1 B.Z. și L.Y. a contribuit în mod egal la această lucrare.

Contribuțiile autorului: Z.Y., Y.L. și J.-D.J.H. cercetare proiectată; B.Z., L.Y., S.L., J.H., H.C., L.H., J.W., L.Z. și H.X. cercetări efectuate; B.Z., L.Y., S.L., C.D.G., X.H., M.K., Y.L. și J.-D.J.H. a analizat datele; și B.Z., L.Y., S.L., C.D.G., X.H., M.K., Y.L. și J.-D.J.H. a scris ziarul.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Acest articol este o trimitere directă PNAS. V.D.L. este un editor invitat invitat de comitetul editorial.

Depunerea datelor: datele despre microarray raportate în această lucrare au fost depuse în baza de date Genn Expression Omnibus (GEO), www.ncbi.nlm.nih.gov/geo (numere de acces GSE36836 și GSE36838).

Vezi Rezumatul autorului la pagina 7154 (volumul 109, numărul 19).