Shawna L. Stratton

4 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Colegiul de Medicină

experimental

Cindy L. Henrich

4 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Colegiul de Medicină

Nell I. Matthews

4 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Colegiul de Medicină

Anna Bogusiewicz

4 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Colegiul de Medicină

Amanda M. Dawson

4 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Colegiul de Medicină

Thomas D. Horvath

4 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Colegiul de Medicină

Suzanne N. Owen

4 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Colegiul de Medicină

Gunnar Boysen

4 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Colegiul de Medicină

Jeffery H. Moran

4 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Colegiul de Medicină

Donald M. Mock

4 Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Colegiul de Medicină

Date asociate

Abstract

Introducere

Biotina este o vitamină solubilă în apă care servește drept cofactor necesar pentru cinci carboxilaze care catalizează etapele esențiale în metabolismul intermediar uman (1-3). Studiile indică faptul că deficitul marginal de biotină asimptomatică este teratogen la mai multe specii de animale, inclusiv la mamifere (4-8). Având în vedere studiile recente care indică faptul că deficiența marginală de biotină se dezvoltă frecvent în timpul gestației umane normale, a existat o cercetare sporită a mecanismelor potențiale ale teratogenezei în modele de mamifere și non-mamifere, precum și eforturi sporite de identificare a indicatorilor umani valabili ai stării biotinei (9, 10 ).

Adesea, studiile care induc deficitul de vitamine au fost efectuate într-un cadru intern. Din motive de cost și de acceptare a participanților, studii mai recente au avut tendința de a fi efectuate într-un cadru ambulatoriu cu sprijin dietetic puternic (11). Studiile care induc experimental carența de biotină la om au fost efectuate în mod uniform într-un cadru intern, cum ar fi un CRC 8. Aceste studii au utilizat în mod caracteristic o dietă bogată în albuș de ou nedenaturat livrat ca băutură consumată cu mesele, iar perioadele de epuizare variază de la 3 la 12 săptămâni (12-15). Albușul de ou conține avidină, o glicoproteină tetramerică care leagă 4 mol biotină/mol proteină cu afinitate foarte mare.

Deși au reușit să inducă un deficit marginal de biotină asimptomatică, studiile anterioare efectuate de laboratorul nostru au necesitat multă muncă și au fost costisitoare. O contribuție importantă la cheltuieli a fost proiectarea studiului internat. Fiecare studiu a folosit o interacțiune zilnică cu dieteticienii, asistenții medicali și personalul CRC. Mesele pentru participanții concepute pentru a avea un conținut scăzut de biotină au fost planificate cu atenție, pregătite și servite de personalul dietetic CRC. În plus, participanții au fost găzduiți în CRC timp de 28 de zile de internare.

Am căutat să determinăm dacă deficiența marginală de biotină ar putea fi indusă la oameni într-un design ambulatoriu mai puțin costisitor, care încorporează o dietă generală auto-selectată, mixtă. În plus, am examinat sensibilitatea relativă a mai multor indicatori validați ai stării biotinei în timpul severității crescânde a deficitului.

Participanți și metode

Determinarea capacității de legare a biotinei a sursei de avidină.

Pentru a determina empiric capacitatea de legare a biotinei a avidinei (Belovo) utilizate în proiectele de studiu 1 și 2, stoichiometria de legare a biotinei a fost evaluată utilizând o analiză de deplasare optică a colorantului (HABA) așa cum s-a descris anterior (16). Testul HABA a arătat că avidina se leagă o medie de 3,5 mol biotină/mol avidină.

Studiul mouse-ului.

Studii umane.

Această cercetare a fost aprobată de Consiliul de revizuire instituțională al Universității din Arkansas pentru științe medicale. Consimțământul informat scris a fost obținut de la fiecare participant ca parte a procesului de consimțământ în curs. Criteriile de incluziune au inclus o sănătate bună fără antecedente de boală renală. Criteriile de excludere au inclus istoricul actual de fumat (18), consumul de suplimente alimentare cunoscute a conține biotină și o istorie recentă a terapiei cu anumite medicamente cunoscute pentru a accelera catabolismul biotinei, cum ar fi anumite anticonvulsivante (19-21). Opt participanți (5 femei; vârsta medie de 36 de ani; interval de 23-56 de ani) au finalizat cu succes studiul. Un participant (femeie) a finalizat proiectul de studiu 1 și 2. Un alt participant (femeie) a finalizat proiectele de studiu 1, 2 și 3.

Suficiența biotinei pe d 0 a fost asigurată în fiecare dintre cele 3 proiecte de studiu prin încărcarea și spălarea biotinei înainte de începerea fazei de epuizare a studiilor, așa cum s-a descris anterior (15). Pentru a asigura suficiența altor vitamine, toți participanții au consumat zilnic un supliment multivitaminic fără biotină în timpul fazei de epuizare a celor 3 modele de studiu; conținutul suplimentului multivitaminic a fost descris anterior (15).

După finalizarea regimului de spălare, participanții au fost văzuți ca pacienți ambulatori în CRC la data de 0 și au început regimul de epuizare a biotinei. Regimul de epuizare a biotinei a constat dintr-o dietă generală auto-selectată, mixtă, cu evitarea alimentelor cu conținut ridicat de biotină, inclusiv carne de organe, ouă, bietă elvețiană și nuci. Epuizarea biotinei a fost indusă de consumul de avidină purificată sub formă de capsulă sau de o băutură albă de ou cu mese și gustări (rezumate în Tabelul suplimentar 1). Participanții au continuat regimul de epuizare până la j 27. Aporturile de biotină au fost monitorizate bi-săptămânal, utilizând istoricul dietei 3-d.

În proiectele de studiu 1 și 2, participanții au consumat capsule compuse din comerț (Custom Compounding Pharmacy) care conțin avidină purificată înainte de fiecare masă și gustare. Un număr suficient de capsule au fost consumate în fiecare zi pentru a furniza

14 mg (207 nmol) avidină (proiectarea studiului 1). Această masă de avidină va lega de 7 ori aportul mediu estimat de biotină al participanților la studiu pe baza istoricului și analizei dietei 3-day de Nutritionist Pro, versiunea 2.4 (First DataBank) și prin referire la tabelele conținutului de biotină al alimentelor determinate de Dr. Laboratorul Mock, unde nu a fost găsit conținut publicat de biotină de către A.M.D. (Dietetician de cercetare CRC). În proiectarea studiului 2,

A fost consumată 28 mg (414 nmol) de avidină pe zi (de 14 ori mai mult decât aportul estimat de biotină din dietă). Pe baza analizei dietetice, aportul de biotină a fost aproximativ proporțional cu consumul de energie. În consecință, participanților li s-au administrat cutii de pilule cu un aport de avidină de 1 săptămână, împărțite în doze adaptate individual consumului tipic de energie al fiecărei persoane pentru 3 mese și 1 gustare/zi.

În proiectul de studiu 3, avidina a fost consumată în băuturile albușului de ou (Michael Foods) prevăzute cu 3 mese și 1 gustare/zi, așa cum s-a descris anterior (13-15). Băutura furnizată cu albus de ou

35% din aportul zilnic de energie și de 7 ori aportul mediu estimat de biotină al participanților la studiu; relația cu aportul de energie și aportul de biotină este similară studiilor anterioare de succes. Băuturile cu albuș de ou au fost repartizate între mese și gustări în funcție de aportul de energie al participantului individual dintr-un istoric dietetic reprezentativ 3-d, așa cum este descris mai sus pentru distribuirea capsulei de avidină. Băuturile au fost făcute în lot, refrigerate și distribuite participanților la fiecare 4 zile. Participanții au fost instruiți să refrigereze băuturile și să consume jumătate din băutură chiar înainte de masă și restul băuturii împreună cu masa.

Participanții la cele 3 proiecte de studiu au reluat starea biotinei după faza de epuizare a biotinei consumând o dietă auto-selectată, nelimitată și o multivitamină zilnică. Multivitaminele au avut aceeași formulare ca multivitaminele utilizate în faza de epuizare, cu excepția faptului că suplimentul conținea și 30 μg de biotină. Regimul de repletie a fost inițiat la data de 29 și a fost continuat timp de 2 săptămâni. Nivelurile de excreție a biotinei urinare au fost monitorizate la toți participanții cu până la 30 de zile suplimentare pentru a se asigura că biotina urinară a tuturor participanților a atins intervalul normal înainte de externarea din studiu.

Recoltarea probelor de sânge și urină.

Sângele venos periferic a fost colectat de la participanții la post într-o seringă heparinizată la d 0, 14 și 28 a fazei de epuizare și la d 48 a fazei de reumplere, așa cum s-a descris anterior (22). Celulele mononucleare din sânge periferic și plasma au fost obținute din sânge prin centrifugare cu gradient de densitate și au fost depozitate la -70 ° C așa cum s-a descris anterior (22).

S-au obținut colecții complete de urină pentru perioada de 24 de ore care se termină la 0800 la d 0, 7, 14, 21 și 28 în timpul epuizării și la d 48 în timpul reîncărcării. Colecțiile de urină de cinci ore au fost obținute pe d 0, 7, 14, 21 și 28 după ce a fost administrat un test de provocare a leucinei, așa cum s-a descris anterior (23). Probele au fost procesate și stocate așa cum s-a descris anterior (14).

Determinarea indicatorilor sanguini și urinari ai stării biotinei.

Activitățile PCC limfocitare au fost măsurate prin încorporarea a 14 CO2, așa cum s-a descris anterior (22). Activitățile au fost normalizate prin conținutul de proteine ​​limfocitare. Plasma 3HIA-carnitina a fost extrasă și cuantificată prin cromatografie lichidă-tandem MS așa cum s-a descris anterior (24, 25). Biotina urinară a fost cantitativă prin HPLC și testul de legare a avidinei, așa cum s-a descris anterior (26). 3HIA urinar a fost cuantificat prin cromatografie lichidă ultra-performantă-tandem MS, așa cum s-a descris anterior (27). 3HIA-carnitina urinară a fost cantitativă în urina diluată fără extracție prealabilă prin cromatografie lichidă-tandem MS, așa cum s-a descris anterior (28). Excreția tuturor indicatorilor urinari a fost normalizată prin concentrația urinară de creatinină. Creatinina urinară a fost determinată prin metoda acidului picric utilizând un analizor automat de creatinină (Beckman Life Sciences) așa cum s-a descris anterior (29).

Analize statistice.

Pentru cele 3 modele de studiu, diferențele dintre diferiții indicatori medii de grup în timpul epuizării au fost testate pentru semnificație prin ANOVA cu o singură cale, cu măsuri repetate. Când este semnificativ (P tabelul 1 ). La toți cei 5 participanți, activitatea PCC limfocitară a scăzut la mai puțin decât limita inferioară a normalului ( FIG. 1A ). 3HIA urinară și 3HIA-carnitină au crescut la mai mult decât limita superioară a normalului (Fig. 1B, D). Biotina urinară a scăzut sub normal și la toți cei 5 participanți (Fig. 1E). De remarcat, 3HIA-carnitina urinară a fost anormală la toți cei 5 participanți până la 7, în timp ce 3HIA urinară și biotina au fost anormale la doar 3 din 5 participanți. Concentrația plasmatică a 3HIA-carnitinei a crescut la mai mult decât intervalul normal la 4 din cei 5 participanți (Fig. 1C).

TABELUL 1

Gradul de deficit de biotină marginală indus de d 28 în proiectul 3 al studiului ambulatoriu este similar cu studiul anterior 1 internat