Bi-Zhen Gao
1 Universitatea Fujian de Medicină Tradițională Chineză, Fujian 350122, China
2 Laboratorul cheie Fujian al statului TCM Health, Universitatea Fujian de Medicină tradițională chineză, Fujian 350122, China
Ji-Cheng Chen
3 Departamentul de endocrinologie, Spitalul de medicină tradițională chineză din orașul Quanzhou, Fujian 362002, China
Ling-Hong Liao
1 Universitatea Fujian de Medicină Tradițională Chineză, Fujian 350122, China
2 Laboratorul cheie Fujian al statului TCM Health, Universitatea Fujian de Medicină tradițională chineză, Fujian 350122, China
Jia-Qi Xu
1 Universitatea Fujian de Medicină Tradițională Chineză, Fujian 350122, China
Xiao-Feng Lin
1 Universitatea Fujian de Medicină Tradițională Chineză, Fujian 350122, China
Shan-Shan Ding
1 Universitatea Fujian de Medicină Tradițională Chineză, Fujian 350122, China
2 Laboratorul cheie Fujian al statului TCM Health, Universitatea Fujian de Medicină tradițională chineză, Fujian 350122, China
Abstract
Decoctul Erchen (ECD) este o rețetă tradițională de medicină chineză, care este utilizată în tratamentul obezității, hiperlipidemiei, ficatului gras, diabetului, hipertensiunii și a altor boli cauzate de păstrarea umezelii flegmei. În acest studiu am investigat mecanismul potențial al ECD, folosind șoareci cu dizabilități de metabolism induse de o dietă bogată în grăsimi. Au fost detectate greutatea corporală și circumferința abdominală. OGTT a fost măsurat prin colectarea probelor de sânge din vena cozii. Nivelul lipidelor din sânge și insulina au fost măsurate folosind un kit de testare biochimică. PCR în timp real a fost utilizată pentru a măsura expresia genei CDKAL1 și Western blot a fost utilizată pentru a măsura expresia proteinei. Prin cercetare, s-a constatat că ECD a arătat o greutate corporală și o circumferință abdominală semnificativ mai mici decât cele din grupul HFD. În mod consecvent, am observat că ECD a îmbunătățit semnificativ toleranța la glucoză, a promovat secreția de insulină și a scăzut nivelul TG, TC. Între timp, am observat o creștere semnificativă a nivelului de mARN și proteine CDKAL1 în grupul ECD. Prin urmare, speculăm că mecanismul molecular potențial al ECD este de a promova expresia CDKAL1, de a ameliora funcția celulelor insulelor și de a crește nivelul de insulină pentru a regla tulburarea metabolică.
1. Introducere
CDKAL1 este localizat pe cromozomul 6, 6P22.3, iar lungimea sa completă este de 37 kb. ARNm-ul CDKAL1 este extrem de exprimat în țesuturile osoase, musculare, pancreasice și cerebrale din corpul uman. În ultimii ani, o parte a studiului arată că CDKAL1 este o metiltiotransferază la mamifere care catalizează modificarea 2-metiltio (ms2) a N6-treonilcarbamoiladenozinei (t6A) pentru a produce 2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenozină (ms2t6AN) [poziția U2] în poziția 37 12]. Modificarea ms2 a tRNALys (UUU) stabilizează interacțiunea cu codonii săi înrudiți, permițând o traducere eficientă. CDKAL1 induce secreția de insulină prin inducerea unei traduceri precise a proteinelor insulinei [13]. Studiile clinice și studiile pe animale au sugerat că ECD poate promova secreția de insulină. În acest studiu, am dori să explorăm mecanismele moleculare ale ECD în tratamentul SM, observându-i efectul asupra expresiei CDKAL1 la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi.
2. Materiale și metode
2.1. Prepararea medicamentelor și dieta
2.2. Animale și intervenții
Animalele SPF (șoareci masculi C57BL/6J, 20 g ± 2 g) au fost obținute de la Shanghai Slac Laboratory Animal Company (Shanghai, China). Șoarecii au fost adăpostiți într-o cameră SPF, temperatură (24 ° C ± 2 ° C) și umiditate controlată (55% ± 10%), cu un ciclu lumină-întuneric de 12 ore (începând cu lumina la 08:00) în experimentul pe animale centrul Universității Fujian din TCM. Protocolul experimental a fost aprobat de Comitetul de Etică al Universității Fujian din TCM pentru utilizarea animalelor experimentale (numărul 2014-004). Animalele au fost randomizate în 2 grupuri: grupul normal (NFD, n = 8), alimentat cu dietă obișnuită și grupul cu dietă bogată în grăsimi (HFD, n = 32), alimentat cu dietă bogată în grăsimi. După 10 săptămâni, șoarecii din grupul HFD au fost randomizați în 4 grupuri: grupul model (HFD, n = 8), grupul de decoct Erchen (ECD, n = 8), grupul cu metformină (MFN, n = 8, fiecare șoarecelui i se administrează 0,3 g/kg metformină), iar grupului de simvastatină (SVN, n = 8, fiecărui șoarece i se administrează 2 mg/kg simvastatină). Fiecare grup, respectiv, administrează medicamentul corespunzător prin gavaj pe cale orală timp de 4 săptămâni. Toți șoarecii puteau mânca și bea ad libitum. Greutatea corporală și circumferința abdominală au fost înregistrate la fiecare 2 săptămâni.
2.3. Test de toleranță intraperitoneală la glucoză
În săptămâna 10, săptămâna 12 și la sfârșitul tratamentului, șoarecii au fost postiti peste noapte (12 ore). Valorile inițiale ale glucozei (0 min), înainte de injectarea de glucoză (1 g/kg greutate corporală), au fost măsurate prin colectarea probelor de sânge din vena cozii. Probele de sânge suplimentare au fost colectate la intervale regulate (30, 60 și 120 min) pentru teste de toleranță la glucoză.
2.4. Analiza chimiei serice
Șoarecii au fost postiti peste noapte și anesteziați. Probele de sânge au fost colectate din sinusurile retroorbitale ale fiecărui grup. Trigliceridele serice (TG), colesterolul total (TC), colesterolul HDL (HDL-c) și colesterolul LDL (LDL-c) au fost măsurate folosind un kit de testare biochimică conform instrucțiunilor producătorului (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) . Insulina serică a fost măsurată folosind un kit ELISA conform instrucțiunilor producătorului (Shanghai Westang Bio-Tech Co. Ltd., Shanghai, China).
2.5. PCR în timp real pentru analiza ARNm
ARN-ul total a fost extras din țesuturile adipoase subcutanate hepatice și adipoase viscerale folosind reactiv Trizol (TaKaRa, Otsu, Japonia). ADN-ul complementar pe prima catenă (ADNc) a fost generat de transcriptază inversă, cu primeri aleatori (TaKaRa, Otsu, Japonia). Secvențele primerilor sunt descrise în Tabelul 1. Pentru a evalua expresia ARNm a CDKAL1 în țesuturile adipoase subcutanate și viscerale hepatice, PCR în timp real a fost efectuată folosind un kit SYBR Green master mix (TaKaRa, Otsu, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului în timp real Mastercycler ep realplex4S Sistem PCR (Eppendorf, Hamburg, Germania). ADNc a fost denaturat la 95 ° C timp de 10 min urmat de 40 de cicluri de PCR (95 ° C, 15 s; 60 ° C, 60 s). Metoda 2 −ΔΔCt [15] a fost utilizată pentru a determina cantitățile relative de produs, iar datele sunt prezentate ca schimbare a pliurilor, utilizând β-actina ca control endogen.
tabelul 1
Lista grundurilor.
| CDKAL1 | ATCGGGGTTCAGCAGATAGAT | TCTTCGGCAAATCCAGTCGAG |
| β-actină | GGCTGTATTCCCCTCCATCG | CCAGTTGGTAACAATGCCATGT |
2.6. Izolarea proteinelor și Western Blot
Țesuturile adipoase subcutanate hepatice și adipoase viscerale ale fiecărei grupe au fost omogenizate în azot lichid și proteina din celule întregi a fost extrasă utilizând tampon de lizat care conține inhibitor de proteinază (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Concentrația de proteine a fost cuantificată spectrofotometric prin utilizarea unui kit de testare a proteinelor BSA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Probele de proteine au fost separate prin PAGE folosind geluri SDS-poliacrilamidă 10%. Probele au fost transferate în membrana fluorurii de poliviniliden și blocate cu lapte 5%. Membrana a fost incubată cu un anticorp primar anti-CDKAL1 de iepure (1: 500, Abcam, Cambridge, Anglia) peste noapte la 4 ° C și urmat de anticorpul secundar (împotriva iepurelui, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) timp de 1 oră la 37 ° C Anticorpii primari incluzând anti-β-actina de șoarece (1: 1000, Sigma, America) au fost similari. În cele din urmă, fiecare bandă de proteine a fost detectată folosind chemiluminescență îmbunătățită (ECL, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Valorile densitometrice au fost măsurate cu Gel-Pro Analyzer.
2.7. Analize statistice
Analizele datelor au fost efectuate folosind programul statistic SPSS 19.0. Toate datele au fost prezentate ca medii ± SE. Testul t-eșantioane independente a fost efectuat pentru a compara două grupuri. ANOVA a fost efectuat pentru a compara mai multe grupuri. Diferențele au fost considerate semnificative, P 0,05.
- Curdlan previne deficitele cognitive induse de o dietă bogată în grăsimi la șoareci prin axa intestinală
- Cafeaua previne afecțiunile hepatice grase induse de o dietă bogată în grăsimi prin modularea căilor
- Supraexprimarea CYP2J2 atenuează boala hepatică grasă nealcoolică indusă de dieta bogată în grăsimi la șoareci
- Dieta cronică bogată în grăsime afectează colectarea funcției vasului limfatic la șoareci
- Comparația programelor de rapamicină la șoareci pe o dietă bogată în grăsimi - PubMed