Xiaoying Yang

1 Laboratorul cheie Jiangsu de imunitate și metabolizare, Departamentul de biologie patogenă și imunologie, Universitatea medicală Xuzhou, Xuzhou, China

Mingxuan Zheng

1 Laboratorul cheie Jiangsu de imunitate și metabolizare, Departamentul de biologie patogenă și imunologie, Universitatea medicală Xuzhou, Xuzhou, China

Shanshan Hao

1 Laboratorul cheie Jiangsu de imunitate și metabolizare, Departamentul de biologie patogenă și imunologie, Universitatea medicală Xuzhou, Xuzhou, China

Hongli Shi

1 Laboratorul cheie Jiangsu de imunitate și metabolizare, Departamentul de biologie patogenă și imunologie, Universitatea medicală Xuzhou, Xuzhou, China

Danhong Lin

1 Laboratorul cheie Jiangsu de imunitate și metabolizare, Departamentul de biologie patogenă și imunologie, Universitatea medicală Xuzhou, Xuzhou, China

Xi Chen

2 Institutul de cercetare medicală și sănătate Illawarra (IHMRI), Școala de Medicină, Universitatea din Wollongong, Wollongong, NSW, Australia

Alec Becvarovski

2 Institutul de cercetare medicală și sănătate Illawarra (IHMRI), Școala de Medicină, Universitatea din Wollongong, Wollongong, NSW, Australia

Wei Pan

1 Laboratorul cheie Jiangsu de imunitate și metabolizare, Departamentul de biologie patogenă și imunologie, Universitatea medicală Xuzhou, Xuzhou, China

Peng Zhang

1 Laboratorul cheie Jiangsu de imunitate și metabolizare, Departamentul de biologie patogenă și imunologie, Universitatea medicală Xuzhou, Xuzhou, China

Minmin Hu

1 Laboratorul cheie Jiangsu de imunitate și metabolizare, Departamentul de biologie patogenă și imunologie, Universitatea medicală Xuzhou, Xuzhou, China

Xu-Feng Huang

2 Institutul de cercetare medicală și sănătate Illawarra (IHMRI), Școala de Medicină, Universitatea din Wollongong, Wollongong, NSW, Australia

Kuiyang Zheng

1 Laboratorul cheie Jiangsu de imunitate și metabolizare, Departamentul de biologie patogenă și imunologie, Universitatea medicală Xuzhou, Xuzhou, China

Yinghua Yu

1 Laboratorul cheie Jiangsu de imunitate și metabolizare, Departamentul de biologie patogenă și imunologie, Universitatea medicală Xuzhou, Xuzhou, China

Date asociate

Toate seturile de date generate pentru acest studiu sunt incluse în articol/Material suplimentar.

Abstract

Introducere

Obezitatea, o problemă majoră de sănătate la nivel mondial, nu este numai strâns asociată cu diabetul zaharat de tip 2, bolile cardiovasculare, cancerul, depresia și alte boli cronice, ci este, de asemenea, un factor de risc pentru bolile neurodegenerative, cum ar fi boala Alzheimer (AD) și demența vasculară. (Fruh, 2017; O'Brien și colab., 2017). Neuroinflamarea este un semn distinctiv al bolilor neurodegenerative asociate cu o dietă bogată în grăsimi (HF) (Francis și Stevenson, 2013; Subhramanyam și colab., 2019). Microbiota intestinală joacă un rol important în funcția și comportamentele creierului prin axa intestin-creier, în timp ce disbioza microbiotei este crucială în neuroinflamarea și afectarea cognitivă (Erny și colab., 2015; Sharon și colab., 2016). De exemplu, dezvoltarea creierului este anormală atunci când microbiota intestinală este absentă la animalele fără germeni (Gareau și colab., 2011; Clarke și colab., 2013). Cercetări anterioare în rozătoare fără germeni și tratate cu antibiotice, fără agenți patogeni, au arătat că disbioza microbiotei intestinale influențează negativ neurogeneza hipocampului și dezvoltarea creierului prin activarea microgliei (Erny și colab., 2015; Sharon și colab., 2016). Prin urmare, o disbioză a microbiotei intestinale este evident un factor cheie de inițiere a neuroinflamării și a disfuncției neuronale ulterioare (Frohlich și colab., 2016; Rogers și colab., 2016; Sharon și colab., 2016).

În studiul de față, a fost utilizat un model de șoarece dietetic HF pentru a induce tulburări cognitive și, ulterior, pentru a evalua efectele suplimentării dietetice cu curdlan asupra diferiților parametri, inclusiv compoziția microbiotei intestinale, grosimea mucusului colonic și proteina de joncțiune strânsă și nivelul endotoxinei serice (LPS). . În plus, eficacitatea pro-cognitivă a curdlanului în acest model a fost evaluată prin examinarea neuroinflamării, a nivelurilor de proteine ​​sinaptice și a ultrastructurii cortexului prefrontal (PFC) și a hipocampului, care sunt două domenii cheie implicate în cunoaștere. Prezentul studiu oferă primele dovezi că suplimentarea dietetică cu curdlan poate ameliora disbioza intestinală și proteja împotriva afectării cognitive în obezitatea indusă de dietă, prin axa intestin-creier.

Materiale și metode

Animale și tratament

Bună analiză a microbiotei

ADN-ul a fost extras din conținutul cecal și secvențierea ARNr 16S a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Sun și colab., 2019). ADN-ul genomic din conținutul cecal a fost extras utilizând trusa de ADN HiPure pentru scaun (Magen, Beijing, China). Regiunea V4 a genelor ARNr 16S au fost amplificate și secvențiate pe platforma Illumina Miseq 2500 (Shanghai Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd., Shanghai, China). Unitățile operaționale taxonomice (OTU) și taxonomia fiecărei secvențe de gene 16S rRNA au fost analizate după cum sa raportat anterior (Zhang și colab., 2019).

Determinarea LPS

Concentrația serică a LPS a fost determinată folosind un kit cromogen de punct final TAL (Xiamen Bioendo Technology Co., Ltd., Xiamen, China). Absorbanța a fost măsurată la 545 nm folosind un spectrofotometru (Asuragen ClinBio128, Statele Unite), cu concentrații măsurabile cuprinse între 0,1 și 1,0 EU/ml. Toate probele pentru măsurătorile LPS au fost efectuate în duplicat.

Colorare histologică și imunohistochimie

Testarea comportamentală

Memoria ordinii temporale, recunoașterea obiectelor noi și testele de labirint Y au fost efectuate pentru a examina efectele dietetice asupra memoriei spațiale și de recunoaștere pe baza metodelor descrise anterior (Jin și colab., 2016; Uribe-Marino și colab., 2016; Zhang și colab. ., 2019). În testul de memorie în ordine temporală, indicele de discriminare a fost calculat ca [(Timp cu obiectul mai vechi - Timp cu obiectul recent)/Timp total cu ambele obiecte] × 100. În testul de recunoaștere a obiectelor noi, indicele de discriminare a fost evaluat utilizând formula, [Timp cu obiect recent - Timp cu obiectul mai vechi)/Timp total cu ambele obiecte] × 100. Pentru testul labirintului Y, alternanța a fost definită ca intrarea succesivă succesivă în fiecare dintre cele trei brațe. Tripletul de alternanță (%) a fost calculat ca [număr de alternanțe reușite/(numărul total de intrări de arme –2) × 100].

Microscopie electronică cu transmisie (TEM)

După perfuzia transcardică cu soluție salină, s-au scos țesuturile cerebrale și s-au disecat 1 mm 3 de blocuri de țesut din PFC și din regiunile CA1 ale hipocampului. Probele au fost fixate într-un amestec de 2% paraformaldehidă-2,5% glutaraldehidă timp de 24 ore și tratate post-fixare cu 1% tetroxid de osmiu (OsO4) timp de 2 ore, înainte de deshidratare într-o serie de etanol gradat ascendent și încorporare în rășină epoxidică. Secțiunile (70 nm) au fost tăiate și colorate cu 4% acetat de uranil și 0,5% citrat de plumb. Ultrastructura sinapselor din regiunea PFC și CA1 a hipocampului a fost măsurată la microscopul electronic cu transmisie (FEI, Portland, OR, Statele Unite) și au fost studiate morfometria sinaptică. Densitatea postsinaptică, lățimea fisurilor sinaptice și curbura interfeței sinaptice au fost determinate utilizând software-ul ImageJ, așa cum s-a descris anterior (Wu și colab., 2013).

Western Blotting

Testele Western blot au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (Xu și colab., 2018). Pe scurt, proteinele au fost extrase din colon, hipocamp și PFC în tampon de liză celulară care conține tampon RIPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Statele Unite), inhibitor de protează Cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Statele Unite) ) și 1 mM PMSF (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Statele Unite). După cuantificarea prin test BCA (Beyotime Biotech, Beijing, China), 40-80 μg de proteine ​​au fost separate folosind 10% SDS-PAGE și apoi electrotransferate în membrane de difluorură de poliviniliden (PVDF) (BioRad, Hercules, CA, Statele Unite). Testele Western blot au fost efectuate folosind anticorpi primari specifici pentru Occludin (ab167161, abcam, Marea Britanie, diluție 1: 2.000), factor neurotrofic derivat din creier (BDNF) (ANT-010, laboratoare Alomone, Israel, diluție 1: 200), PSD- 95 (# 3450, Cell Signaling Technology, Boston, MA, Statele Unite, 1: 1.000 diluție) și GAPDH (A2077, ABclonal Biotechnology Co., Ltd., Statele Unite, 1: 2.000 diluție). Anticorpul secundar a fost IgG anti-iepure conjugat cu peroxidază de hrean (sc-2030, Santa Cruz Biotechnology, Statele Unite, diluție 1: 2.000). Imunodetecția a fost efectuată folosind substratul Western Blot Clarity TM ECL (Bio-Rad, Statele Unite) și vizualizată cu sistemul de imagistică ChemiDoc Touch (Bio-Rad, Statele Unite).

Extracția ARN și PCR cantitativ (q) în timp real (qPCR)

Extracția ARN și qPCR au fost efectuate pe baza metodelor descrise anterior (Mei și colab., 2019). Pe scurt, ARN-ul total a fost extras cu TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Statele Unite) din colon, hipocamp și PFC. Apoi, 2 μg ARN a fost transcris invers în ADNc folosind un kit de transcripție inversă ADNc de mare capacitate (Takara, Japonia). qPCR a fost efectuat folosind SYBR GREEN Master Mix (TaKaRa, Japonia) și determinat pe un sistem de detectare PCR în timp real (Bio-Rad, Statele Unite). Nivelurile de ARNm pentru gene specifice au fost calculate utilizând formula 2 (–ΔΔCt) și normalizate prin niveluri de ARNm de β-actină. Toate grundurile sunt listate în Tabelul 1 suplimentar.

Analize statistice

curdlan

Efectele suplimentării acute de curdlan asupra aportului de energie, greutății corporale și comunităților microbiene intestinale la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (IC) timp de 7 zile. (A) Abundența relativă de Firmicutes, (B) abundența relativă de bacteroidete, (C) raportul dintre proporția Firmicutes și proporția Bacteroidetes (Raport FM/BO), (D) abundența relativă de proteobacterii și (E) abundența relativă a antinobacteriilor. Valorile sunt medii ± erori standard ale mediilor. n = 5. * p # p ## p ### p 2.0 a fost considerat semnificativ.

Efectele suplimentării cronice cu curdlan asupra microgliozei și inflamației în cortexul prefrontal (PFC) și hipocampul șoarecilor hrăniți cu o dietă HF. (A, B) Colorarea imunohistochimică a Iba1 în PFC (A) și regiunea cornus ammonis (CA1), CA2-3 și regiunea giratorie dentată (DG) a hipocampului (B); (C - J) Expresia ARNm a TNF-a, IL-6, IL-1β și IL-10 în PFC (C - F) și hipocamp (G - J). Valorile sunt medii ± erori standard ale mediilor. n = 5. * p # p ## p ### p Figurile 5A - D). Cu toate acestea, în comparație cu dieta HF, suplimentarea cu curdlan a atenuat aceste modificări ale ultrastructurii sinaptice, prezentând PSD mai groase și o despicătură sinaptică mai îngustă (toate p Figurile 5A - D). Între timp, am măsurat și nivelurile de proteine ​​ale markerilor de plasticitate sinapsă, BDNF și densitatea postsinaptică-95 (PSD-95) în PFC și hipocampus de șoareci. În PFC, expresia BDNF, dar nu PSD-95, a fost inhibată de dieta HF; cu toate acestea, această scădere a BDNF nu a fost evidentă la șoarecii HFCurd [BDNF: F (2,12) = 11,5, p = 0,0016, PSD-95: F (2,12) = 0,9973, p = 0,3975, Figurile 5E, F ]. În hipocampus, atât BDNF cât și PSD-95 au fost scăzute la șoarecii HF; cu toate acestea, niciuna dintre aceste reduceri nu a fost observată la șoarecii HFCurd [BDNF: F (2.12) = 5.698, p = 0.0182, PSD-95: F (2.12) = 13.72, p = 0.0008, Figurile 5G, H]. Aceste rezultate indică faptul că curdlan ar putea îmbunătăți morfologia sinaptică și plasticitatea în PFC și hipocamp.

În acest studiu, efectele curdlanului asupra îmbunătățirii cognitive au fost examinate numai la șoarecii obezi masculi. Studiul șoarecilor masculi a fost efectuat deoarece se raportează că șoarecii masculi dezvoltă o mai mare măsură a deficitelor cognitive induse de obezitate sau diabet decât șoarecii femele (Fan și colab., 2018). Mai mult, studiul șoarecilor masculi poate evita efectele estrogenului și ovarelor asupra comportamentului cognitiv. Mai mult, studiile au arătat diferențe de sex în obezitate și neuroinflamare (Fan și colab., 2018; Link și Reue, 2017). De exemplu, s-a raportat că femelele sunt protejate de răspunsul inflamator indus de dieta occidentală datorită efectelor protectoare ale receptorului de estrogen α (Sample și Davidson, 2018), în timp ce șoarecii masculi au o inflamație mai mare în sistemul nervos central în scleroza multiplă model animal (Du et al., 2014). Prin urmare, efectele suplimentării cu curdlan asupra axei cognitive și intestin-creier la șoareci femele ar trebui examinate în continuare în viitorul studiu înainte de traducerea curdlanului în studiile clinice la femei.

Pe scurt, prezentul studiu a demonstrat că suplimentarea dietetică cu curdlan previne deficitele cognitive induse de o dietă HF la șoareci. Aceste efecte benefice pot fi atribuite axei colon-creier. Descoperirile noastre oferă dovezi ale mecanismului prin care curdlan - ca aditiv alimentar și prebiotic - poate fi utilizat în prevenirea afectării cognitive induse de consumul excesiv al dietei occidentale.

Declarație privind disponibilitatea datelor

Toate seturile de date generate pentru acest studiu sunt incluse în articol/Material suplimentar.

Declarație de etică

Studiul pe animale a fost revizuit și aprobat de Comitetul de etică al Universității Medicale Xuzhou.