Wilson Mitsuo Tatagiba Kuwabara

1 Departamentul de Fiziologie și Biofizică, Institutul de Științe Biomedice, Universitatea din São Paulo, São Paulo, Brazilia

goto-kakizaki

Ana Carolina Panveloski-Costa

1 Departamentul de Fiziologie și Biofizică, Institutul de Științe Biomedice, Universitatea din São Paulo, São Paulo, Brazilia

Caroline Naomi Fukusawa Yokota

1 Departamentul de Fiziologie și Biofizică, Institutul de Științe Biomedice, Universitatea din São Paulo, São Paulo, Brazilia

Joice Naiara Bertaglia Pereira

1 Departamentul de Fiziologie și Biofizică, Institutul de Științe Biomedice, Universitatea din São Paulo, São Paulo, Brazilia

2 Universitatea Cruzeiro do Sul, São Paulo, Brazilia

Jorge Mancini Filho

3 Facultatea de Științe Farmaceutice, Universitatea din São Paulo, São Paulo, Brazilia

Rosangela Pavan Torres

3 Facultatea de Științe Farmaceutice, Universitatea din São Paulo, São Paulo, Brazilia

Sandro Massao Hirabara

2 Universitatea Cruzeiro do Sul, São Paulo, Brazilia

Rui Curi

1 Departamentul de Fiziologie și Biofizică, Institutul de Științe Biomedice, Universitatea din São Paulo, São Paulo, Brazilia

2 Universitatea Cruzeiro do Sul, São Paulo, Brazilia

Tatiana Carolina Alba-Loureiro

1 Departamentul de Fiziologie și Biofizică, Institutul de Științe Biomedice, Universitatea din São Paulo, São Paulo, Brazilia

Date asociate

Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Abstract

Introducere

Până în 2030, diabetul zaharat (DM) va fi cea de-a șaptea cauză de deces la nivel mondial, rămânând în urmă doar a bolilor cardiace ischemice, a bolilor cerebrale, a HIV/SIDA, a bolii pulmonare obstructive cronice (BPOC), a infecțiilor respiratorii inferioare și a traheei, bronhiei și cancer pulmonar [1]. Incidența DM a crescut vertiginos și, în 2014, așa cum a susținut Organizația Mondială a Sănătății (OMS), a atins semnul distinctiv al 422 de milioane de indivizi [2]. Această creștere se datorează în principal obiceiurilor alimentare nesănătoase, cum ar fi aportul crescut de zahăr, grăsimi, alimente procesate și băuturi îndulcite, legate de consumul redus de fructe și legume, precum și de stilul de viață sedentar. DM este asociată cu complicații care afectează calitatea vieții pacienților, de exemplu, mai mult de 50% dintre pacienții diabetici prezintă alte tulburări fiziologice, cum ar fi bolile cardiovasculare (atacuri de cord și accidente vasculare cerebrale) [3], susceptibilitate mai mare la infecții [4], insuficiență renală [5] și retinopatie [6].

DM este un sindrom caracterizat prin tulburări ale metabolismului carbohidraților, lipidelor și proteinelor și apare ca urmare a deficienței/absenței secreției de insulină sau a rezistenței la acțiunea acestui hormon. DM de tip 2 (T2DM) este cel mai comun tip de DM și se caracterizează prin rezistența la insulină în mușchiul scheletic, țesutul adipos și ficatul. Funcția secretorie a celulelor β defecte, hiperglicemia și hiperinsulinemia în repaus și producția crescută de glucoză hepatică sunt, de asemenea, semnele distinctive ale T2DM [7]. Dezvoltarea T2DM se datorează unei combinații de trei factori diferiți: genetic, de mediu și comportamental [8]. În acest studiu, ne propunem să comparăm două dintre componentele care interferează în dezvoltarea T2DM: factorii genetici versus factorii de mediu (dieta).

Șobolanul Goto Kakizaki (GK), un model experimental T2DM non-obez și spontan (genetic), a fost utilizat pe scară largă pentru a investiga dezvoltarea T2DM și complicațiile sale [9-14]. Aceste animale au fost obținute prin repetarea creșterii selective a șobolanilor Wistar intoleranți la glucoză [15]. Șobolanii masculi și femele sunt afectați în mod similar de starea diabetică și diferențele sunt observate chiar înainte de naștere. În uter, GC fetal prezintă o masă redusă a celulelor β pancreatice; cu toate acestea, imediat după naștere, șobolanii prezintă glicemie normală. Când șobolanii GK au vârsta de 28 de zile, se observă hiperglicemie bazală, secreție de insulină afectată de celulele β pancreatice și producție crescută de glucoză hepatică [16-18]. Abia după 56 de zile de viață, șobolanii GK dezvoltă rezistență la insulină periferică [19]. Având în vedere că factorul genetic contribuie la etiologia și progresia T2DM, au fost dezvoltate diverse studii pentru a identifica genele susceptibile în modelul GK. Recent, genele implicate în mai multe căi care pot fi asociate cu fenotipul T2DM au fost observate la șobolanii GK. [20-22].

Dieta bogată în grăsimi (HFD) este frecvent utilizată ca strategie experimentală de dezvoltare a obezității și T2DM la rozătoare, simulând o influență a mediului asupra metabolismului acestor animale. Hrănirea HFD a fost descrisă pentru prima dată în șoarecii C57BL/6 de către Surwit și colab. [23], arătând că HFD conținând 58% din energie derivată din grăsimi duce la obezitate, hiperinsulinemie inițială, homeostazie afectată de glucoză datorită rezistenței la insulină și producție de insulină tardivă insuficientă la eșecul celulelor pancreatice β [24]. Aceste diete sunt îmbogățite cu grăsimi saturate și promovează creșterea în greutate prin extinderea țesutului adipos alb (WAT), modificarea homeostaziei lipidelor, diferențierea adipocitelor și supraviețuirea. În consecință, aceste modificări, expansiunea WAT ​​promovează o stare inflamatorie și infiltrarea leucocitelor [25-27]. Expunerea cronică la HFD induce leziuni hepatice [28], afectarea homeostaziei glucozei, hiperinsulinemie compensatorie pentru menținerea glicemiei normale (în stadiul inițial), eșecul pancreatic tardiv al celulei β la producerea insulinei din cauza epuizării celulare și a hiperglicemiei, care sunt principalele caracteristici din T2DM [29-31].

Având în vedere că prevalența T2DM crește la nivel global și că acest sindrom este rezultatul interacțiunilor diferiților factori, este important să înțelegem mecanismele modificate în T2DM și să promovăm opțiuni alternative pentru a minimiza consecințele și progresia acestei boli. În acest studiu, investigăm mecanismele moleculare ale rezistenței la insulină induse de două modele diferite: șobolani GK (genetici) și HFD care induc obezitatea (mediu - dietă). Ne așteptăm ca concluzia acestei lucrări să ajute alți cercetători să își aleagă modelul experimental adecvat atunci când își propun să studieze cauzele și consecințele T2DM.

Material si metode

1. Animale

Șobolanii Goto Kakizaki și Wistar au fost obținuți de la Charles River Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA, SUA) și întreținut în unitatea noastră de animale din cadrul Departamentului de Fiziologie și Biofizică al Institutului de Științe Biomedicale, Universitatea din Sao Paulo. Șobolanii au fost menținuți la 23 ± 2 ° C sub un ciclu de 12 ore de lumină și 12 ore de întuneric, fiind permis accesul liber la alimente și apă. Șobolanii masculi au fost hrăniți cu chow standard pentru rozătoare (Nuvilab ®, Curitiba, PR, Brazilia) până la vârsta de 8 săptămâni. Apoi, animalele au fost alocate aleatoriu în trei grupuri: grupurile de control și grupurile GK au hrănit o dietă de control, iar grupul Wistar a hrănit un HFD (60%) (Tabelul 1). Animalele au primit dietele specifice timp de opt săptămâni [32, 33]. Dietele au fost obținute de la Rhoster Company (Araçoiaba da Serra, SP, Brazilia) și compoziția lor a fost stabilită pe baza Research Diets, Inc. (New Brunswick, NJ, SUA): D12450B (control) și D12492 (HFD). Comitetul de etică animală al Institutului de Științe Biomedice al Universității din Sao Paulo (numărul 109/2013) a aprobat toate procedurile experimentale ale acestui studiu. Creșterea în greutate corporală a fost evaluată săptămânal, iar aportul alimentar a fost măsurat de trei ori pe săptămână.

tabelul 1

Ingrediente Dieta de control (10% Kcal de grăsime) Dieta hiperlipidică (60% Kcal de grăsime)
Cazeină (80 ochiuri)200 g (800 Kcal)200 g (800 Kcal)
L-Cystein3 g (12 Kcal)3 g (12 Kcal)
Amidon de porumb315 g (1260 Kcal)0 g (0 Kcal)
Maltodextrină 1035 g (140 Kcal)125 g (500 Kcal)
Zaharoza350 g (1400 Kcal)68,8 g (275,2 Kcal)
Celuloză (BW200)50 g (0 kcal)50 g (0 kcal)
Ulei de soia25 g (225 Kcal)25 g (225 Kcal)
Untură20 g (180 Kcal)245 g (2205 Kcal)
Amestec de minerale> S1002610 g (0 Kcal)10 g (0 Kcal)
Fosfat dicalcic13 g (0 Kcal)13 g (0 Kcal)
Carbonat de calciu5,5 g (0 Kcal)5,5 g (0 Kcal)
Citrat de potasiu16,5 g (0 Kcal)16,5 g (0 Kcal)
Mix de vitamine V1000110 g (40 Kcal)10 g (40 Kcal)
Bitartrat de colină2 g (0 Kcal)2 g (0 Kcal)
Total1055 g (4057 Kcal)773,8 g (4057 Kcal)

2. Analize metabolice

2.1. Testul de toleranță la glucoză (GTT) și nivelurile de insulină

După 12 ore de post, animalele au fost injectate (i.p.) cu o soluție de glucoză 50%, folosind o doză de 2 g/Kg (b.w.). Concentrația de glucoză din sânge a fost determinată utilizând un monitor de glucoză din sânge (AccuCheck, Roche, SP, Brazilia). Probele de sânge au fost obținute dintr-un vârf de coadă tăiat înainte (0 min) și la următoarele puncte de timp după injectarea glucozei: 15, 30, 60, 90 și 120 min. Nivelul de insulină a fost măsurat de ELISA, conform instrucțiunilor producătorului (Merck Millipore, Darmstadt, Germania).

2.2. Test de toleranță la insulină (ITT)

După 12 ore de post, animalele au fost injectate (i.p.) cu insulină (Humulin R; Eli Lilly, Indianapolis, SUA), folosind o doză de 0,5 UI/Kg (b.w.). Probele de sânge au fost obținute dintr-un vârf de coadă tăiat înainte (0 min) și la următoarele puncte de timp după injectarea insulinei: 4, 8, 12, 15, 20 și 30 de minute. Rata constantă pentru testul de toleranță la insulină (kITT) a fost calculată pe baza regresiei liniare a concentrațiilor de glucoză din sânge obținute de la 0 la 30 min din curba ITT [34, 35].

2.3. Măsurarea metaboliților plasmatici

Nivelurile de FFA plasmatice au fost determinate folosind testul colorimetric enzimatic (NEFA C) de la Wako Chemicals GmbH, conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile plasmatice ale trigliceridelor, colesterolului total și HDL au fost determinate folosind teste colorimetrice enzimatice de la BioClin (Minas Gerais, Brazilia), conform instrucțiunilor producătorului. Valorile LDL au fost obținute prin ecuația Friedewald [36]. HOMA-IR și HOMAb au fost calculate așa cum a fost descris de Matthews și colab. [37].

3. Extracția lipidelor și determinarea compoziției acizilor grași din plasmă prin cromatografie gazoasă

4. Determinarea transaminazei glutamil oxaloacetice (GOT) și a transaminazei glutamil piruvice (GPT)

GOT și GPT au fost măsurate în plasma animalelor de 12 ore postite, utilizând testul colorimetric de la LabTest (Minas Gerais, Brazilia), conform instrucțiunilor producătorului.

5. Semnalizarea insulinei în mușchiul scheletului solei

După 4 ore de post, șobolanii au fost anesteziați cu clorhidrat de xilazină și soluție de ketamină prin i.p. injectare la 8 și, respectiv, 80 mg/kg m.w. (Virbac do Brasil, São Paulo, Brazilia). Mușchiul Soleus a fost îndepărtat, izolat cu atenție și rapid și incubat așa cum a fost descris anterior de Crettaz și colab. [40] și Challiss și colab. [41] și efectuate în mod obișnuit de grupul nostru [42, 43] Pe scurt, mușchii solei au fost preincubați la 35 ° C în tampon de bicarbonat Krebs-Ringer, pH 7,4 și menținut timp de 30 de minute cu 95% O2 și 5% CO2 conținând 5,5 mM glucoză, la 90 de oscilații/min. După 30 de minute, mușchii au fost transferați în flacoane care conțin tampon Krebs în prezența sau absența insulinei (7 nM) și incubați timp de 20 de minute. După incubare, mușchii au fost imediat omogenizați în tampon RIPA (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA) conținând cocktail inhibitor de protează (Roche, Basel, Elveția), la 4 ° C, folosind un Polytron PT-MR 3100 (Kinematica AG, Luzern, Elveția), operat la viteză maximă, timp de 30 de secunde. Extractele de țesut au fost centrifugate la 10.000 x g la 4 ° C timp de 10 minute și supernatanții colectați pentru analiza Western blot.

6. Semnalizarea insulinei în ficat și țesutul adipos

După 4 ore de post, șobolanii au fost anesteziați așa cum s-a descris mai sus. Cavitatea abdominală a fost accesată și o felie de ficat și porțiunea de țesut adipos retroperitoneal au fost îndepărtate și omogenizate imediat în tampon RIPA (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA), conținând un cocktail inhibitor de protează (Roche, Basel, Elveția) la 4 ° C, folosind un Polytron, așa cum este descris mai sus. După îndepărtarea inițială a țesuturilor (stare bazală), s-a accesat vena portă și s-a injectat 0,5 ml soluție de insulină (preparată în 0,9% NaCI), conținând o doză de 2 UI/Kg (b.w). După 60 s și 120 s, o altă felie de ficat și o altă porțiune a țesutului adipos retroperitoneal au fost îndepărtate (stare stimulată de insulină), respectiv, și omogenizate așa cum s-a descris mai sus. Toate extractele de țesut au fost centrifugate la 10.000 x g, la 4 ° C, timp de 10 minute, și supernatanții colectați pentru analiza Western blot.

7. Analiza Western blot

Conținutul de proteine ​​a fost determinat în supernatantul extractelor de țesut folosind kitul BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA) și s-a adăugat la probe 4x Laemmli Sample Buffer [44]. Cantități egale de proteine ​​(20 μg) au fost rezolvate în SDS-PAGE și transferate în membranele de nitroceluloză. Membranele au fost blocate timp de 1 oră la temperatura camerei cu lapte degresat de 5% și incubate cu anticorpii primari specifici peste noapte. După incubare cu anticorp secundar conjugat cu hrean peroxidază. Benzile au fost detectate cu sistemul de chemiluminescență îmbunătățit (Amersham Biosciences). Imunoblotii au fost cuantificați utilizând software-ul ImageJ ® și colorarea Ponceau a fost utilizată ca control interior [45, 46]. Anticorpii policlonali fosfo-AKT, fosfo-GSK-3β, GSK-3β au fost cumpărați de la Cell Signaling (Danvers, MA, SUA); Anticorpul policlonal AKT a fost achiziționat de la Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, SUA); Anticorpii policlonali IL-1 β, TNF-α, IL-6 și IL-10 au fost cumpărați de la Abcam (Cambridge, MA, SUA).

8. Analize histologice ale feliilor de ficat

8.1. Evaluarea morfo-cantitativă

8.2. Acumularea de grăsime hepatică

Ficatul a fost inclus în mediul Tissue-Tek®, congelat în azot lichid și au fost obținute secțiuni de 10 μm și aderate pe lamele silanizate. Lamele au fost fixate în paraformaldehidă tamponată 4%, spălate în apă distilată și colorate cu ulei roșu O și hematoxilină pentru analiza lipidelor. Evaluarea calitativă a diapozitivelor a fost realizată folosind microfotografii capturate cu microscopul Zeiss Axiovert 40, cu un obiectiv de 40x (Camera: Zeiss AxioCam ERc 5s).

8.3. Conținutul de glicogen hepatic

Diapozitivele hepatice din secțiunea înghețată (10 μm) au fost colorate cu Acid-Schiff Periodic (PAS) și hematoxilină pentru detectarea glicogenului hepatic. Evaluarea calitativă a diapozitivelor a fost realizată folosind microfotografii capturate cu microscopul Zeiss Axiovert 40, cu un obiectiv de 40x (Camera: Zeiss AxioCam ERc 5s).

9. Analize histologice ale infiltratului inflamator în țesutul adipos retroperitoneal

Țesutul adipos retroperitoneal a fost inclus în mediul Tissue-Tek®, congelat în azot lichid și au fost obținute secțiuni de 5 μm și aderate pe lamele silanizate. Diapozitivele au fost colorate cu HE. Evaluarea infiltratului leucocitar a fost efectuată și prin imunohistochimie. Diapozitivele au fost blocate cu 3% BSA și incubate peste noapte cu anticorp de șoarece anti-șobolan CD11b/c de șoarece (BD Pharmingen ™, 1: 1000). Ulterior, țesutul a fost incubat cu IgG anti-șoarece biotinilat (Jackson ImmunoResearch, 1: 200) anticorp secundar timp de 2 ore, spălat cu tampon fosfat 0,1 M și incubat cu kit VectaStain ABC (Vector Laboratories, 1: 100) timp de 2 ore. Detectarea complexului antigen-anticorp a fost efectuată prin cromogen 3,3'-diaminobenzidină (DAB) timp de 5 minute la temperatura camerei. Secțiunile fără anticorpul primar (Cd11b/c) au fost utilizate ca control negativ al procesului de imunomarcare. Evaluarea calitativă a diapozitivelor a fost realizată folosind microfotografii capturate cu microscopul Zeiss Axiovert 40, cu un obiectiv de 40x (Camera: Zeiss AxioCam ERc 5s).

10. Analiza datelor

Rezultatele sunt prezentate ca medie ± S.E.M. Semnificația statistică a fost evaluată prin ANOVA unidirecțională sau bidirecțională, urmată de post-testul Bonferroni. p ≤ 0,05 a fost considerat semnificativ statistic.

Rezultate

HFD a indus obezitatea la șobolanii Wistar. Șobolanii GK au fost rezistenți la creșterea în greutate, prezentând, după 8 săptămâni de tratament, o creștere cu 28% și 42% mai mică în comparație cu grupul martor și, respectiv, cu animale hrănite cu HFD (Fig. 1A și 1B). Cu toate acestea, atunci când s-a măsurat consumul de energie, șobolanii GK au consumat mai multă energie pe zi pe Kg decât grupurile martor și HFD, când consumul de alimente și energie a fost normalizat în funcție de greutatea corporală (Fig. 1F). Chiar dacă animalele hrănite cu HFD au prezentat o creștere mai mare în greutate, HFD și grupurile de control au avut cantități egale de consum de energie pe zi (Fig. 1C - 1F).