1 University of Tropical Clinic and Centre of Malaria and Tropical Children-LA, Institutul de igienă și medicină tropicală, Universitatea din Lisabona, Rua da Junqueira 100, 1349-008 Lisabona, Portugalia

2 Departamentul de Pediatrie, Spitalul Dona Estefânia, Rua Jacinta Marto, 1169-045 Lisabona, Portugalia

3 Serviço de Pediatria Instituto Português de Oncologia de Lisboa Francisco Gentil, Rua Professor Lima Bastos, 1099-023 Lisboa, Portugal

4 Program absolvent în domenii de biologie de bază și aplicată, Institutul de Științe Biomedice Abel Salazar, Universitatea din Porto, Rua Dr. Roberto Frias, s/n, 4200-465 Porto, Portugalia

Abstract

Giardia duodenalis este cea mai răspândită infecție cu protozoare intestinale mai ales la copii. În Portugalia sunt disponibile date puține despre această infecție la preșcolari. Prezentul studiu a fost realizat din aprilie până în iulie 2009 în grădinițele publice din Lisabona înrolând 316 de copii. Examenul scaunului a fost efectuat prin microscopie. Analiza moleculară a fost efectuată în toate probele pozitive pentru G. duodenalis pentru a determina asamblarea și subansamblarea acestui parazit. Opt dintre copiii preșcolari studiați (2,5%, 8/316) au fost infectați cu G. duodenalis. În plus, fratele unuia dintre copiii infectați a fost, de asemenea, infectat. Direcționarea analizei genotipurilor ssu-ARNr și β-grădină loci au dezvăluit șase infecții cu ansamblul A și 3 cu ansamblul B. Determinarea subansamblării a fost posibilă în patru dintre probe, cu trei A2 și unul A3. Numărul limitat de cazuri a împiedicat asocierea unui anumit simptom cu un ansamblu. Datele prezentate aici arată relevanța luării în considerare G. duodenalis analiza la copiii cu afecțiuni intestinale chiar și în țările dezvoltate.

1. Introducere

Giardiaza este o boală intestinală răspândită cauzată de Giardia duodenalis. Acest parazit protozoar are o distribuție globală, infectând oamenii și o gamă largă de gazde de mamifere [1]. Prevalența giardiozei la om în țările dezvoltate este de 2-7% [2], în timp ce poate varia între 20 și 30% în țările în curs de dezvoltare [3].

Spectrul manifestărilor clinice în giardioza umană este relativ variabil, variind de la absența simptomelor la diaree acută sau cronică, deshidratare, dureri abdominale, greață, vărsături și scădere în greutate [4]. Copiii sunt afectați în special, cu consecințe mai grave decât adulții. Cu toate acestea, impactul Grădină infecția la dezvoltarea copiilor nu este clară. Unele studii au arătat efecte dăunătoare asupra stării nutriționale și a funcției cognitive mai slabe la copiii cu giardioză [5-8], în timp ce altele au arătat că giardioza nu a afectat creșterea copilariei [9]. Factorii gazdei, cum ar fi starea imunitară, starea nutrițională și vârsta, sunt recunoscuți ca factori determinanți importanți pentru severitatea infecției [10]. Cu toate acestea, studii privind posibila asociere între G. duodenalis asamblările și severitatea bolii s-au dovedit până acum inconsistente [11].

Instrumentele moleculare au demonstrat asta G. duodenalis este un complex de specii care cuprinde cel puțin opt ansambluri (A - H), dintre care doar A și B au fost găsite infectând oameni [12].

Studiile anterioare s-au concentrat asupra prevalenței giardiozei la copiii preșcolari (3-4%) [13, 14], pe G. duodenalis determinarea ansamblurilor la om [13, 15], animale și apă [15, 16] și, mai recent, asupra prevalenței și a factorilor de risc pentru G. duodenalis infecție la copii [17].

Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă există vreunul G. duodenalis la copiii preșcolari înscriși, ansamblurile și relația lor cu datele clinice din orașul Lisabona.

2. Material și metode

2.1. Proiectarea studiului, populația și eșantionul

Un studiu transversal a fost realizat din aprilie până în iulie 2009. Populația din studiu a fost cu toții preșcolari (3306 de copii) care au participat în acel an la preșcoli publice sub supravegherea Primăriei din Lisabona. Selecția grădinițelor în care a fost realizat studiul a fost decisă de orașul Lisabona, cu scopul de a reflecta o mai largă socioeconomie a familiilor și o dispersie geografică a copiilor. Numărul copiilor implicați a fost de 685.

Un total de 316 (46,1%, 316/685) copii preșcolari, cu vârste cuprinse între 3 și 6 ani, care frecventează grădinițele selectate ale rețelei de școli publice, au fost înscriși în acest studiu. Toți copiii din școli au fost invitați să participe. Copiii înscriși au fost cei ai căror părinți au colectat probele de scaun și au semnat consimțământul informat.

2.2. Colectie de mostre

A avut loc o întâlnire cu directorul fiecărei școli, precum și cu părinții pentru a explica obiectivele studiului, înainte de colectarea probelor.

Recipientele pentru scaun au fost livrate părinților sau tutorilor într-o zi de vineri. Părinților/tutorilor li s-a spus să colecteze trei probe de scaun în zile consecutive fără nicio inducție farmacologică și depozitate la 4 ° C până luni dimineață, când echipa a mers la școli pentru a colecta toate probele.

2.3. Microscopie

Probele proaspete de scaun au fost examinate G. duodenalis și alți paraziți intestinali prin analize microscopice în ser fiziologic și, de asemenea, în iod. Mai mult, metoda de concentrație a formoleterului a fost, de asemenea, efectuată pentru a crește sensibilitatea detectării. Toate probele au fost examinate de trei microscopi diferiți, pentru rezultate de verificare încrucișată. Mostre pozitive pentru G. duodenalis au fost păstrate în hârtie de filtru (Generation Card Kit, Qiagen) și conservate la -20 ° C pentru analize ulterioare.

2.4. Extracția ADN și amplificarea PCR

ADN-ul a fost extras din probele conservate în hârtie de filtru. Un protocol de extracție a ADN pentru pete de sânge uscate (Generation Capture Card Kit, Qiagen) a fost adaptat pentru probele de scaun. Modificările aduse protocolului original au inclus triplarea volumelor de soluții utilizate, cu excepția etapei finale de eluare (100 μL) [18]. Pentru unele probe, ADN-ul a fost extras folosind volume de eluție de 25 μL. Toate probele au fost amplificate folosind primerii care vizează ARN ribozomal subunitate mică (ssu-ARNr) [19, 20] și β-grădină (bg) loci [21, 22].

Reacțiile de amplificare au fost efectuate folosind 2 μL de șablon ADN într-un volum final de 25 μL, folosind margele ilustratoare PuReTaq Ready-To-Go PCR (GE Healthcare, Marea Britanie). Atât pozitiv (ADN izolat din tulpina Portland-1 (ATCC 30888DLGC Promochem), cât și controale negative (fără șablon adăugat) au fost incluse în fiecare serie de reacții PCR. Produsele PCR au fost vizualizate pe gel de agaroză 2% colorat cu bromură de etidiu.

2.5. Analiza secvenței

Pentru analiza secvenței, produsele PCR au fost purificate folosind JETQUICK Gel Extraction Spin Kit/50 (Genomed, Germania) conform instrucțiunilor producătorului. Reacțiile de secvențiere a ADN-ului au fost efectuate în ambele direcții folosind primerii GiarF/GiarR pentru ssu-ARNr fragment de genă (175 pb) [20] și cele descrise anterior [22] pentru β-grădină fragment de genă (511 pb). Secvențele obținute în acest studiu au fost aliniate cu secvențele publicate anterior de G. duodenalis izolate disponibile în baza de date GenBank, utilizând ClustalW.

2.6. Date clinice și tratament

Un chestionar pentru datele clinice referitoare la copii a fost completat de părinții sau tutorele fiecărui participant.

Toți copiii infectați cu G. duodenalis au fost ajutați de un medic pediatru de la Clinica de Boli Tropicale din Institutul de Igienă și Medicină Tropicală și tratați pentru infecție cu 15 mg/kg/zi de metronidazol împărțit în trei doze zilnice, timp de șapte zile. La trei săptămâni după tratament au fost obținute noi probe de scaun pentru a confirma eficacitatea tratamentului. Dacă un copil a fost infectat cu vreun parazit intestinal, ceilalți membri ai gospodăriei au fost invitați să își colecteze scaunele care au fost, de asemenea, examinate pentru a găsi paraziți intestinali.

2.7. Considerații etice

Prezentul studiu a fost prezentat și aprobat de Comitetul Etic al Institutului de Igienă și Medicină Tropicală, Lisabona. Consimțământul informat scris a fost obținut de la toți părinții sau tutorii legali ai copiilor care participă la studiu.

3. Rezultate

3.1. Rezultate parazitologice

Dintre cei 316 de copii care au participat la acest studiu, 166 (52,5%) erau bărbați și 150 (47,5%) erau femei. Vârsta medie a fost de 5,03, variind între trei și șase ani. G. duodenalis a fost singurul parazit patogen găsit în fecale. G. duodenalis chisturile au fost găsite în 8 din cele 316 de probe examinate prin microscopie (2,5%), corespunzând a patru dintre școlile incluse în această lucrare. Mai mult, un membru al familiei (fratele), dintr-unul dintre copiii infectați, a fost, de asemenea, infectat cu G. duodenalis.

3.2. Caracterizarea genotipării

Cele nouă mostre pozitive pentru G. duodenalis au fost amplificate cu succes pentru ssu-ARNr fragment de genă și pentru bg gene au fost amplificate doar șapte probe (77,8%, 7/9) (Figurile 1 și 2).

clinică

Separarea electroforetică a ssu-ARNr Produse PCR (175 pb). Benzi 1-9, G. duodenalis probe pozitive prin microscopie; benzi (+), control pozitivG. duodenalis ADN, Strain Portland-1, ATCC 30888DTM LGC Promochem); benzi M, scară 100 bp; benzile Nt1 și Nt2, controale negative (fără ADN) de la prima și respectiv a doua reacție PCR.


Separarea electroforetică a β-grădină Produse PCR (511 pb). Benzi 1-9, G. duodenalis probe pozitive prin microscopie; benzi (+), control pozitivG. duodenalis ADN, Strain Portland-1, ATCC 30888DTM LGC Promochem); benzi M, scară 100 bp; benzile Nt1 și Nt2, controale negative (fără ADN) de la prima și respectiv a doua reacție PCR.

Ssu-ARNr secvențele obținute în acest studiu au fost comparate cu secvențe omoloage găsite în GenBank folosind BLAST. Șase probe aparțin ansamblului A și trei la B (Tabelul 1). Secvențe obținute pentru bg gena au fost, de asemenea, comparate cu secvențele publice de la GenBank folosind BLAST. În plus, bg secvențele au fost analizate pentru discriminarea subansamblării în conformitate cu polimorfismele genetice descrise în altă parte [23]. Izolatele 3, 4 și 5 aparțin subansamblului A2, în timp ce celălalt izolat (6) aparține subansamblului A3 (Tabelul 1).

Pentru celelalte două izolate, 7 și 8, aparținând ansamblului B, nu a fost posibil să se determine subansamblul respectiv datorită variabilității ridicate a nucleotidelor observată în cromatogramă.

Noi probe de scaun au fost colectate de la toți copiii infectați după tratamentul complet și analiza. Niciun parazit nu a fost detectat prin microscopie.

3.3. Date clinice

În momentul recoltării eșantionului de scaun, doar patru copii au raportat simptome (1, 3, 4, 5), inclusiv lipsa poftei de mâncare, dureri abdominale și flatulență (Tabelul 1).