Subiecte
Abstract
Comunitățile microbiene sunt omniprezente atât în mediul natural, cât și în cel artificial. Cu toate acestea, diversitatea microbiană este de obicei redusă sub presiuni puternice de selecție, cum ar fi cele prezente în habitate bogate în compuși recalcitranti sau toxici care prezintă proprietăți antimicrobiene. Cofeina este un alcaloid natural prezent în cafea, ceai și băuturi răcoritoare cu proprietăți antibacteriene bine-cunoscute. Aici vă prezentăm prima analiză sistematică a bacteriilor asociate mașinii de cafea. Am prelevat rezervorul de deșeuri de cafea a zece mașini Nespresso diferite și am efectuat o monitorizare dinamică a procesului de colonizare într-o mașină nouă. Rezultatele noastre dezvăluie existența unei comunități bacteriene variate în toate mașinile prelevate și un proces rapid de colonizare a lichidului de cafea. Comunitatea s-a dezvoltat dintr-un bazin pionier de enterobacterii și alți taxoni oportunisti la un microbiom matur, dar încă foarte variabil, bogat în bacterii adaptate la cafea. Comunitățile bacteriene descrise aici, pentru prima dată, sunt potențiali factori determinanți ai proceselor relevante din punct de vedere biotehnologic, incluzând decofeinizarea și bioremediere.
Introducere
Cofeina (1,3,7-trimetilxantină) este un alcaloid natural cu proprietăți anti-erbivore produs de Cafea arabă și Coffea canephora, care este prezent într-o gamă largă de băuturi, inclusiv cafea, ceai și băuturi răcoritoare (în principal cola). Cofeina este un bine-cunoscut compus bioactiv cu efecte stimulatoare asupra sistemului nervos central, împreună cu o serie de alte efecte potențial pozitive asupra sănătății umane. Astfel de efecte variază de la îmbunătățirea memoriei pe termen lung 1, îmbunătățirea performanței sportive 2, inactivarea miofibroblastelor asociate cancerului mamar 3, reducerea riscului de diabet zaharat de tip 2 4 sau chiar reducerea riscului de mortalitate în rândul consumatorilor de cafea 5. Cu toate acestea, trebuie menționat, de asemenea, că obiceiurile de consum de cofeină sunt adesea legate de stilurile de viață și, prin urmare, este dificil să se tragă concluzii epidemiologice care leagă aportul de cofeină de sănătate.
Cofeina poate fi un poluant 6 pentru mediu și a fost, de asemenea, propusă ca un marker ușor de detectat pentru apele uzate netratate 7. Într-adevăr, prezența cofeinei în mediul natural este unul dintre cei mai buni indicatori ai contaminării antropice. Bioactivitatea cofeinei asupra sănătății umane și a mediului a condus la dezvoltarea proceselor de eliminare a cofeinei, fie pentru a produce produse decofeinizate, fie pentru a degrada cofeina din mediu. Decofeinizarea, și anume procesul de eliminare a cofeinei, este utilizată industrial pentru a produce băuturi cu conținut scăzut de cofeină și poate fi implementată și pentru remedierea mediului. O opțiune interesantă este de a utiliza microorganisme pentru a efectua procese de decofeinizare. Unele microorganisme s-au raportat că degradează cofeina, cum ar fi Aspergillus tamarii 8, Trichosporon asahii 9, Pseudomonas sp. 10.11 sau P. putida 12 .
În această lucrare, raportăm o analiză a diversității care vizează caracterizarea comunităților bacteriene care cresc pe deșeurile de leșie de cafea, utilizând tehnici de secvențiere, cultură și microscopie electronică de mare putere. Pentru a atinge acest obiectiv, am ales unul dintre cele mai răspândite sisteme de preparare a cafelei, Nespresso, datorită popularității și naturii sale standard. De fapt, mașinile compatibile Nespresso sunt dispozitive de fabricare a cafelei foarte standardizate (același tip de capsulă, același design de bază, aceeași presiune: 19 bari) și reprezintă o oportunitate unică pentru un screening biologic masiv. Aici vă prezentăm prima încercare de a face acest lucru. Am prelevat tava de scurgere interioară sub recipientul capsulei, în care se acumulează lichidul de cafea. Am analizat zece mașini domestice și semi-domestice și am studiat procesul de colonizare dinamică într-o mașină nouă Inissia Krups funcționată în laboratorul nostru. Aceasta este prima analiză sistematică a diversității microbiene asociate cu aparatele de cafea. Rezultatele noastre pot arunca lumină asupra arsenalului microbian al degradanților de cofeină cu implicații importante atât pentru medicină, cât și pentru biotehnologie.
Rezultate si discutii
Deșeurile de cafea din recipientul capsulei de nouă mașini Nespresso diferite funcționate timp de cel puțin un an au fost prelevate (Fig. 1A). Într-un caz (modelul CityZ), tava pentru ceașcă a fost, de asemenea, eșantionată independent, deoarece nu se conectează la recipientul pentru capsule. Secvențierea și analiza de mare randament a ampliconilor genei ARNr 16S de la toate mașinile au relevat o diversitate bacteriană semnificativă, numărul total de genuri identificate variind de la 35 la 67. Deși au fost detectate profiluri microbiene relativ similare, a existat o variație importantă în frecvența impozitului special. Enterococ sp. și Pseudomonas sp. s-au dovedit a fi taxonii principali deoarece au fost moderat până la foarte abundenți în nouă din cele zece probe analizate. Alte genuri frecvente erau Stenotrophomonas, Sphingobacterium, Acinetobacter și, într-o măsură mai mică, Coprococcus, Paenibacillus sau Agrobacterium. Dysgomonas a fost foarte frecvent în mașina Inissia, reprezentând 15% din secvențe (Fig. 1B). Nu s-au detectat diferențe între modelele de mașini (Tabelul 1) sau utilizarea (domestice vs. comunal).
(A) Reprezentarea schematică a unui aparat Nespresso (1) incluzând un recipient pentru capsule (3) (2), tavă pentru cupe (4) și o tavă pentru picurare (5), care a fost prelevată în această lucrare. (B) Profilul bacterian al celor nouă aparate Nespresso eșantionate în conformitate cu secvențierea genei 16S rRNA. Eșantioane numerotate în conformitate cu tabelul 1.
Unul dintre cele mai frecvente două genuri găsite în aparatele de cafea a fost Pseudomonas, care este, de asemenea, unul dintre puținele exemple raportate ale unei bacterii care degradează cofeina. Într-adevăr, Pseudomonas sp. se știe că catabolizează cofeina din anii șaptezeci [13] și se raportează că degradează până la 15 g/L de cofeină printr-o reacție de N-demetilare, care împreună cu oxidarea C-8 reprezintă cele două căi potențiale catabolice 14. Speciile despre care se arată că prezintă abilități de degradare a cofeinei sunt P. alcaligenes 15 și P. putida (tulpinile C1, CBB1 sau CBB5). De fapt, P. putida Genele N-demetilării au fost folosite pentru a proiecta genetic o versiune „dependentă” de cofeină E coli 16 și eliminarea cofeinei din canalizare prin bioremediere cu P. putida a fost de asemenea propus 17 .
Abundența de Enterococ spp. în lixivierea bogată în cofeină s-ar putea să nu implice neapărat abilități nedeclarate de degradare a cofeinei în Enterococ, dar ar putea fi pur și simplu o consecință a toleranței la anumite niveluri de cofeină. Același lucru se aplică și altor impozite frecvente. Interesant este că acest gen a fost asociat anterior cu cafeaua 18, împreună cu alte câteva detectate în această lucrare. De exemplu, Acinetobacter sp. a fost izolat în timpul fermentării cafelei 19, în timp ce Stenotrophomonas sp., Curtobacterium sp. și Pseudomonas sp. sunt abundente în sămânța de cafea 20 .
Colonizarea bacteriană într-un nou aparat Nespresso Krups Inissia.
(A) Profil bacterian în tava de scurgere în timpul celor două luni de funcționare conform monitorizării genei 16S rRNA. (B) Succesiunea ecologică a taxonilor principali în timpul experimentului, reprezentată ca variația frecvențelor relative ale acestora.
Corelațiile dintre genurile bacteriene detectate în această lucrare.
Distanțele corespund corelației statistice liniare. Mărimile sferelor sunt proporționale cu abundențele relative pe o scară logaritmică. Genurile foarte corelate sunt prezentate în aceeași culoare. Sph, Sphingobium; Bac, Bacil; Aci, Acinetobacter; Ter, Terribacillus; Cur, Curtobacterium; Pae, Paenibacillus; Tigaie, Pantoea; Rhi, Rhizobium; Chr, Chryseobacterium; Aer, Aerococ; Artă, Arthrobacter; Ste, Stenotrophomonas; Ach, Achromobacter; Câini, Pseudomonas; Can, Candidatus Cloacamonas; Agr, Agrobacterium; Bre, Brevundimonas; Ent, Enterococ; Cau, Caulobacter; Dys, Dysgonomonas; Spb, Sphingobacterium; Ped, Pedobacter; Com, Comamonas; Oth, Alte genuri.
Majoritatea taxelor pe care le-am identificat în timpul procesului de colonizare al aparatului de cafea operat în laboratorul nostru au fost găsite anterior în medii naturale legate de cafea. Specii aparținând genurilor Acinetobacter și Bacil și, de asemenea, unele enterobacterii, au fost detectate în timpul fermentării naturale a boabelor de cafea 23,19, în timp ce Paenibacillus și alte specii de Bacteroidete și Firmicutes au cheltuit abundent în procesul de compostare a corpurilor de cafea 24,25. În ciuda unor rapoarte care descriu capacitatea diferitelor Sphingobium specii care degradează molecule toxice, cum ar fi bisfenoli 26 și hidrochinone 27, acesta este primul raport în care Sphingobium sp. a fost asociat unui mediu bogat în cofeină.
În plus față de monitorizarea genei ARNr 16S, am urmărit modificările diversității microbiene de leșiere a cafelei prin microscopie electronică cu scanare (SEM). Figura 4 prezintă o serie dinamică de eșantioane prelevate la diferite puncte de timp (4, 8, 14 și 21 de zile după prima zi de funcționare) în prima lună. Biomasa microbiană a crescut pe parcursul analizei și variațiile în compoziția și vâscozitatea lichidului de cafea au fost, de asemenea, evidente. De exemplu, o matrice filamentoasă a fost observată în zilele 8 și 21 (Fig. 4). În ziua 14, eșantionul a fost dominat de o singură formă de celule bacteriene, care a coincis interesant cu o abundență relativă covârșitoare de Bacil spp. în proba respectivă (Fig. 2A). Sunt necesare experimente suplimentare pentru a determina dacă modificările comunității microbiene sunt cauza sau efectul variațiilor în compoziția leșierului de cafea, așa cum arată SEM.
Serii cronologice de imagini SEM ale probelor de tava de scurgere prelevate după 4 (A), 8B), 14C) și 21 de zile (D) de funcționare. Figura C corespunde unui eșantion foarte abundent în Bacil spp. Barele de scalare sunt indicate în fiecare caz.
Rezultatele noastre arată, pentru prima dată, că levigarea cafelei de la mașinile standard cu capsule este un substrat bogat pentru creșterea bacteriilor; că conținutul de cofeină nu împiedică o bogată biodiversitate bacteriană să colonizeze rapid leșia cafelei; și că succesiunea microbiană dintr-un bazin inițial de bacterii generaliste face loc unui bacteriom aparent adaptat la cafea, dar încă foarte variabil. Acest bacteriom este bogat în specii raportate anterior ca fiind asociate cu planta de cafea și/sau cu procesele de fermentare a cafelei. Bacteriile colonizatoare ar putea fi de origine ecologică (nu au fost detectate microorganisme cultivabile și nici ADN bacterian în capsulele de cafea, date neprezentate), în timp ce eterogenitatea compoziției bacteriene poate avea legătură cu factori precum obiceiurile de curățare și, în special, frecvența utilizării mașinii (cu o frecvențe care se corelează probabil cu volumul și temperatura crescute ale leșierului de cafea). Studii suplimentare care cuprind mai multe aparate de cafea, secvențierea profundă a genomului comunităților microbiene din acestea și chiar metagenomică funcțională, sunt necesare pentru a contribui la luminarea ecologiei microbiene a lichidului de cafea în mașinile cu capsule.
Prezența genurilor bacteriene cu proprietăți patogene și recuperarea rapidă a comunităților după clătirea recipientului capsulei sugerează cu tărie necesitatea întreținerii frecvente a containerului capsulei acestor mașini. Întreținerea trebuie să utilizeze compuși bacteriostatici și să evite contactul cu leșia de cafea cu alte părți ale mașinii, pentru a evita contaminarea neintenționată a băuturii. Pe de altă parte, comunitățile microbiene rezistente pe care le descriem aici (consorții microbiene, specii individuale degradante/tolerante ale cofeinei sau ca sursă de căi metabolice și gene) pot reprezenta un instrument promițător pentru procesele biologice de decofeinizare a cafelei și pentru decontaminarea cofeinei din mediu.
Metode
Prelevarea de probe
Nouă mașini Nespresso, care funcționau de cel puțin un an, folosite fie acasă (interne), fie în departamente academice, institute sau companii de biotehnologie (comunale) din zona Valencia (Spania) au fost prelevate aseptic (Tabelul 1). Cafeaua lixiviată din capsulele irosite prezente în tava de scurgere plasată sub recipientul capsulei a fost prelevată folosind o pipetă Pasteur sterilă. Într-un caz (CityZ), spațiul mic sub grătarul de picurare și facilitățile de susținere a cupei a fost prelevat și tratat separat (Fig. 1A; Tabelul 1). În toate cazurile, temperatura medie a camerei în care au funcționat aparatele de cafea a fost de aproape 25 ° C.
În plus față de aceste mașini, a fost achiziționată o mașină Krups Inissia pentru lucrările prezente și funcționată în mod normal în laboratorul nostru timp de cinci luni, cu o utilizare zilnică de aproximativ 1-5 capsule pe zi. Eșantionarea a fost efectuată la scadențe crescânde de timp și a constat în îndepărtarea majorității (cu excepția a 5 ml, aproximativ) a lichidului lixiviat. Când volumul lixiviatului a fost mai mic de 5 ml, nu s-au prelevat probe. Toate piesele detașabile (grilă de picurare și suport pentru cupă, tava de picurare și recipientul pentru capsule au fost clătite bine o dată (ziua 28) cu apă de la robinet.
În toate cazurile, 2 ml alicote din probe au fost utilizate imediat pentru izolarea ADN-ului, în timp ce volumul rămas a fost depozitat la -80 ° C.
Microscopie prin scanare electronica
Alicote din fiecare probă au fost filtrate printr-un filtru de 0,2 micrometri (Corning Inc.), fixate cu o soluție de paraformalină 2% - 2,5% glutaraldehidă și spălate ușor cu tampon fosfat steril filtrat (PBS). Apoi, bucăți mici ale filtrelor au fost plasate în capsule microporoase (dimensiunea porilor de 30 μm, disponibilă de la numărul de produs Ted Pella Inc. nr. 4619) și supuse etapelor succesive de deshidratare în soluții de creștere a etanolului până la 100% etanol, după uscarea punctului critic într-o Autosamdri 814 (Tousimis). Aceste fragmente au fost apoi plasate pe butuci SEM cu vopsea conductoare de argint TAAB S269 și examinate la microscopul electronic cu scanare Hitachi S-4100.
Izolarea ADN și amplificarea PCR
Secvențierea genei ARNr 16S și analiza datelor bioinformatice
informatii suplimentare
Cum să citiți acest articol: Vilanova, C. și colab. Bacteriomul mașinii de cafea: biodiversitatea și colonizarea leșierii tăvii de cafea irosite. Știință. reprezentant. 5, 17163; doi: 10.1038/srep17163 (2015).