Lucrare de cercetare

  • Articol complet
  • Cifre și date
  • Referințe
  • Suplimentar
  • Citații
  • Valori
  • Licențierea
  • Reimprimări și permisiuni
  • PDF

Abstract

Introducere

Cercetările din ultimul deceniu ne-au mărit înțelegerea modului în care microambientul tumoral influențează dezvoltarea tumorii. Stroma mamară, care cuprinde 80% din sânul normal, cuprinde fibroblaste, endoteliu, mușchi neted, celule inflamatorii și nervoase, adipocite și macromolecule ale matricei extracelulare (ECM) și servește un rol de susținere a celulelor epiteliale. 1 Stroma suferă o serie de modificări funcționale și fenotipice pentru a deveni activate, oferind un mediu permisiv pentru avansarea celulelor epiteliale tumorale. 2 Fiecare tip de celulă al stromei contribuie diferit la tumorigeneză: fibroblastele asociate cancerului produc factori de creștere care stimulează angiogeneza și creșterea celulară, rigiditatea crescută a ECM facilitează invazia, iar macrofagele asociate tumorii facilitează migrarea celulelor tumorale, angiogeneza și remodelarea ECM. 3 Analiza expresiei genelor a celulelor epiteliale, mioepiteliale și endoteliale, leucocite, miofibroblaste și fibroblaste din carcinomul ductal normal in situ și țesuturile mamare invazive au relevat modele de exprimare diferențială a genelor între sânii normali și canceroși în fiecare tip de celulă. 4

diferențe

În ciuda acestui progres în înțelegerea modului în care stroma contribuie la etiologia tumorii mamare, rolul posibil al țesutului adipos, fiind considerat mult timp că funcționează doar ca un depozit inert de stocare a energiei, în tumorigeneză a fost în mare parte ignorat. 5 Țesutul adipos este alcătuit dintr-o gamă diversă de tipuri de celule, inclusiv adipocite, celule stem derivate din adipoză, preadipocite, limfocite, macrofage, fibroblaste și celule endoteliale vasculare. Cercetările din ultimul deceniu au demonstrat că adipozitatea este, de fapt, un organ endocrin activ care secretă adipokine, molecule pro-inflamatorii, chimiocine, hormoni și factori de creștere. 6 În experimentele de co-cultură și modele animale, s-a demonstrat că țesutul adipos contribuie la dezvoltarea și progresia tumorilor mamare. 7

Compresele de țesut adipos

50% din sânul uman, 8 astfel nu se poate realiza o înțelegere completă a modului în care microambientul mamar contribuie la tumorigeneză fără o înțelegere îmbunătățită a modului în care țesutul adipos poate contribui la dezvoltarea și progresia tumorii. Din punct de vedere clinic, rata obezității crește în Statele Unite, conservarea sânilor lasă țesutul adipos potențial tumorigen și transferul autolog de grăsime poate stimula creșterea celulelor tumorale reziduale, toate ducând la recurență crescută și la rezultate slabe la pacienții cu cancer mamar. În acest scop, am efectuat o analiză a expresiei genelor asupra țesutului adipos al tumorii adiacente și îndepărtate de la sânii invazivi și asupra țesutului adipos din sânii non-maligni de la femeile aflate în postmenopauză pentru a (1) compara expresia genelor din țesutul adipos din invaziv și non-invaziv sânii identificând astfel genele asociate cu un risc crescut și (2) compară semnăturile moleculare ale țesutului adipos adiacent și îndepărtat de tumorile invazive pentru a identifica genele care susțin activ dezvoltarea și progresia tumorii.

Rezultate

Probele pacienților

Pentru a genera date microarray folosind ARN izolat după microdisecție laser, au fost necesare randamente minime de 1,8 ng și RIN ≥6,0. Fiecare dintre specimene, adiacente și îndepărtate, de la 30 de pacienți postmenopauzali secvențiali care au suferit mastectomie pentru cancer de sân invaziv au produs ARN de cantitate și calitate suficiente pentru studii de expresie genetică. În schimb, din 46 de femei aflate în postmenopauză cu diagnostice non-maligne, 14 exemplare au generat ARN cu randament insuficient și unul de calitate slabă, rezultând 31 de probe de ARN utilizabile. Majoritatea pacienților din ambele grupuri s-au autodescris ca albi, în timp ce mai mulți dintre pacienții non-maligni au fost menopauzi chirurgical (31%) și mai puțini au fost obezi (25%) comparativ cu pacienții invazivi (3% și respectiv 33%) .

Exprimarea diferențială a genelor în adiacent în comparație cu țesutul adipos îndepărtat

Când s-au comparat modele de expresie genică din țesutul adipos adiacent și îndepărtat de la aceiași sâni, 391 de gene au fost exprimate diferențial cu 20 de gene având o diferență de expresie ≥2,0 ori (Tabelul S1). Probabilitatea de a obține cel puțin 391 de gene semnificative din întâmplare (la nivelul 0,01) dacă nu au existat diferențe reale între clase a fost de 0,002. Genele cu cea mai mare diferență de ori au inclus fosfoproteina secretată 1 (SPP1), subunitatea ribonucleotidereductazei M2 (RRM2), metaloproteinaza 9 matrice (MMP9) și fosfolipaza A2, grupa VII (PLA2G7), care au fost fiecare exprimat> de 3 ori mai mare în țesutul adipos adiacent comparativ cu cel îndepărtat de tumoră. Când s-a efectuat analiza căilor, căile moleculare care implică sistemul imunitar, incluzând atât imunitatea celulelor B, cât și a celulelor T, au fost reglate diferențial între țesutul adipos al tumorii adiacent și cel îndepărtat (Tabelul 1).

Publicat online:

tabelul 1. Căi BioCarta reglementate diferențial între exemplare pereche de țesut adipos adiacent și îndepărtat

Expresia diferențială a genelor în adiacent comparativ cu adiposul non-malign

Comparația țesutului adipos adiacent tumorii și a țesutului adipos de la sânii non-maligne a identificat 928 de gene exprimate diferențial (Tabelul S2), dintre care 180 au demonstrat diferențe de expresie de ≥2,0 ori. Probabilitatea de a obține cel puțin 928 de gene semnificative din întâmplare (la nivelul 0,01) dacă nu au existat diferențe reale între clase a fost de 5 ori mai mari niveluri în țesutul adipos adiacent tumorii în timp ce complexul major de histocompatibilitate, clasa II, DQ-α 1 (HLA-DQA1), complex major de histocompatibilitate, clasa II, DQ-β 1 (HLA-DQB1), proteină inductibilă de prolactină (PIP) și claudin 8CLDN8) au fost exprimate la niveluri de ≥ 5 ori mai mari în țesutul adipos de la sânii non-maligni. Analiza căii a relevat faptul că multe elemente ale imunității celulelor B și T sunt active în țesutul adipos adiacent (Tabelul 2).

Publicat online:

masa 2. Căi BioCarta cu expresie diferențială semnificativă între adipos adiacent și non-malign

Exprimarea diferențială a genelor la distanță comparativ cu adiposul non-malign

Dintre cele 562 de gene exprimate diferențial între țesutul adipos îndepărtat și non-malign (Tabelul S3), 259 (46%) au fost, de asemenea, exprimate diferențial între țesutul adipos adiacent tumorii și non-malign, inclusiv SPP1, RRM2, MMP9 și PLA2G7, care toate sunt exprimate la niveluri> 2,0 ori mai mari la distanță comparativ cu țesutul adipos non-malign. Nivelurile de expresie relativă ale RRM2 între cele trei tipuri de țesut adipos sunt prezentate în Figura 1. Probabilitatea de a obține cel puțin 562 de gene semnificative din întâmplare (la nivelul 0,01) dacă nu au existat diferențe reale între clase a fost o expresie de 3 ori mai mare în țesutul adipos îndepărtat și proteina de legare a acizilor grași 7 (FABP7), Factorul E74 5ELF5), proteina C de legare a miozinei, de tip lent (MYBPC1), matrice metaloproteinazei 7 (MMP7), CLDN8, HLA-DQA1, și HLA-DQB1 având o expresie> de 3 ori mai mare în țesutul adipos non-malign. Analiza căilor a relevat că căile implicate în replicarea ADN, transcrierea, imunitatea celulelor B și răspunsul inflamator sunt reglementate diferențial între țesutul adipos îndepărtat de o tumoră mamară și țesutul adipos non-malign (Tabelul 3).

Publicat online:

figura 1. Niveluri relative de expresie genică a RRM2 în țesutul adipos adiacent tumorii, îndepărtat și non-malign. Datele au fost generate de qRT-PCR în 10 perechi de probe de țesut adipos adiacent și îndepărtat tumoral independent, precum și nouă probe de țesut adipos non-maligne independente. Nivelurile medii de expresie relativă au fost de 3979 în tumorile adiacente, 1428 în cele îndepărtate și 307 în țesutul adipos non-malign. Diamante albastre, țesut adiacent tumorii; triunghiuri roșii, țesut îndepărtat; triunghiuri verzi, țesut non-malign.

figura 1. Niveluri relative de expresie genică a RRM2 în țesutul adipos adiacent tumorii, îndepărtat și non-malign. Datele au fost generate de qRT-PCR în 10 perechi de probe de țesut adipos adiacent și îndepărtat tumoral independent, precum și nouă probe de țesut adipos non-malign independent. Nivelurile medii de expresie relativă au fost de 3979 în tumorile adiacente, 1428 în cele îndepărtate și 307 în țesutul adipos non-malign. Diamante albastre, țesut adiacent tumorii; triunghiuri roșii, țesut îndepărtat; triunghiuri verzi, țesut non-malign.

Publicat online:

Tabelul 3. Rezultate din comparația căii Biocarta între țesutul adipos de sân îndepărtat și non-malign

Discuţie

Importanța micromediului tumoral pentru carcinogeneză a fost recunoscută încă din 1944, când Slaughter a declarat că „cancerul nu apare ca un fenomen celular izolat, ci mai degrabă ca o tendință anaplastică care implică mai multe celule simultan”. 9 Progresia tumorii este promovată de componentele stromale, cum ar fi fibroblastele, celulele endoteliale și ECM, care suferă modificări morfologice și moleculare pentru a susține în mod activ tumorigeneză. Cu toate acestea, aceste modificări nu sunt uniforme la nivelul sânului, ci depind mai degrabă de apropierea de tumoare. De exemplu, celulele canceroase induc stres oxidativ în fibroblastele vecine asociate cancerului (CAF), ceea ce duce la producerea de substanțe nutritive, cum ar fi lactatul din CAF, care promovează apoi supraviețuirea celulelor canceroase; aceste efecte sunt cele mai concentrate în CAF adiacente tumorii, dar pot fi capabile să difuzeze către celule stromale mai îndepărtate. 10 Aici, demonstrăm că profilurile de expresie genică ale țesutului adipos diferă în funcție de distanța față de tumoare.

Analiza căilor sugerează că răspunsul imun este cel mai ridicat în țesutul adipos adiacent tumorii și cel mai scăzut în țesutul adipos de la sânii non-maligni. Țesutul adipos nu este implicat numai în procese precum semnalizarea endocrină, consumul de energie și metabolismul osos, ci și în inflamație și imunitate. În timp ce adipocitele sunt cel mai abundent tip de celule, macrofagele sunt comprimate

10% din țesutul adipos alb. Adipocitele secretă o varietate de factori care pot influența răspunsurile imune și inflamatorii, cum ar fi leptina, care este pro-inflamatorie, și adiponectina, care este antiinflamatoare. 11 Profilarea expresiei genice a celulelor cancerului de sân MDA-MB-231 cultivate cu mediu cultivat cu adipocite a găsit o expresie crescută a genelor implicate în răspunsurile imune și de vindecare a rănilor. Aceste date demonstrează că răspunsul imun al țesutului adipos în sine este dependent de prezența sau apropierea de celulele tumorale mamare.

Al treilea semn distinctiv al CAA este scăderea conținutului de lipide. Celulele tumorale proliferatoare necesită o sursă de energie pentru a se împărți, precum și lipide pentru producerea membranei. Lipoliza adipocitelor adiacente de către celulele epiteliale mamare are loc în timpul alăptării 29; aceasta poate fi cooptată de celulele epiteliale tumorale pentru a oferi tumorilor o sursă de energie. 30 Rolul țesutului adipos ca combustibil nu numai pentru creșterea tumorii, ci și în recrutarea macrofagelor și stimularea unui răspuns inflamator, poate contribui la rezultatele mai puțin favorabile ale pacienților cu cancer de sân obezi. Nivelurile de macrofage ale țesutului adipos au fost de 3 ori mai mari în țesutul adipos de la obezi comparativ cu indivizii slabi 31 și specimenele de mamoplastie reductivă de la femeile obeze au demonstrat un număr crescut de macrofage și răspuns inflamator. 32 Astfel, obezitatea poate fi un factor de risc pentru cancerul de sân prin crearea unui răspuns inflamator în glanda mamară. În acest studiu, 33% dintre pacienții invazivi au fost obezi, comparativ cu 25% dintre pacienții cu boală non-malignă. Diferențele de expresie genetică și răspunsul imunotolerant observat la țesutul adipos al pacienților cu cancer mamar invaziv, prin urmare, pot reflecta o combinație de rate mai mari de obezitate, precum și starea bolii.

Modificările exprimării genelor în țesuturile adipoase de la sânii invazivi pot afecta rezultatele clinice. De exemplu, date recente demonstrează că prezența macrofagelor asociate tumorii, care au un răspuns antiinflamator M2, în stroma tumorii, dar nu și tumora propriu-zisă, este asociată cu un prognostic slab. 33 La pacienții supuși terapiei de conservare a sânilor (BCT), țesutul adipos îndepărtat, care poate avea un fenotip imunotolerant, va persista și un subgrup de pacienți care au BCT cu margini apropiate pot adăposti țesut adipos adiacent tumorii cu proprietățile sale de promovare a tumorii. Prezența celulelor tumorale reziduale sau re-însămânțarea sânului cu celule tumorale primare metastatice ale sânului într-un microambient tumorigen poate favoriza astfel recurența.

În concluzie, țesutul adipos mamar demonstrează diferite profiluri de exprimare a genelor dependente de prezența și apropierea de tumorile mamare. Răspunsurile imune modificate atât în ​​țesutul adipos adiacent tumorii, cât și în țesutul adipos îndepărtat de la sânii invazivi, comparativ cu sânii nemaligni, sugerează că prezența celulelor epiteliale tumorale în glanda mamară este suficientă pentru a conduce la un răspuns antiinflamator pe tot sânul. Genele exprimate la niveluri mai ridicate în tumoarea adiacentă în comparație cu țesutul adipos îndepărtat sunt asociate cu o proliferare celulară crescută, invazie, migrație, angiogeneză și metastază, sugerând că țesutul adipos adiacent tumorii promovează creșterea și progresia tumorii. Împreună, aceste date sugerează că țesutul adipos nu este o componentă inertă a microambientului mamar, ci joacă un rol activ în tumorigeneză.

Pacienți/Metode/Materiale

Probele de țesut uman

Înscrierea pacienților în Proiectul de îngrijire a sânilor clinici (CBCP) a început în 2001. Pentru includerea în CBCP, toți pacienții au îndeplinit următoarele criterii: (1) adult cu vârsta peste 18 ani, (2) competent mental și dispus să ofere informații informate consimțământ și (3) prezentarea centrelor mamare cu dovezi ale unei posibile boli a sânului, pentru mamografii de screening de rutină sau mamoplastie electivă reductivă. Specimenele de țesut au fost colectate cu aprobarea de la Comitetul pentru utilizare umană al Centrului Medical Militar Național Walter Reed și al Comitetului de revizuire instituțională. Toți subiecții înscriși la CBCP au acceptat voluntar să participe și au dat consimțământul scris în scris.

Țesutul a fost colectat de la pacienții supuși unor proceduri chirurgicale, inclusiv lumpectomie sau mastectomie. În decurs de 5-15 minute de la îndepărtarea chirurgicală, țesutul mamar a fost dus pe gheață zdrobită și umedă la laboratorul de patologie unde un patolog autorizat sau asistentul patologului a efectuat analize de rutină a patologiei (caracterizarea brută, evaluarea stării marginilor și alte scopuri indicate). Excesul de țesuturi a fost înghețat în mediu optim de temperatură de tăiere (Sakura Finetek, 4583) pe gheață uscată. Odată conservate, probele de țesut congelate au fost depozitate în congelatoare cu azot lichid.

Baza de date CBCP a fost interogată pentru identificarea tuturor pacienților de sex feminin cu vârsta ≥ 50 de ani sau menopauză chirurgicală care (1) au fost supuși mastectomiei pentru cancer de sân invaziv sau (2) au avut biopsii excizionale care au condus la diagnostice non-maligne cu specimene congelate care conțin țesut adipos adiacent leziunea benignă. Diagnosticul non-malign nu a inclus anomalii detectabile, modificări fibrochistice sau fibroză stromală; au fost excluși pacienții cu celule coloanare sau hiperplazie atipică. Au fost excluși pacienții cu mutații BRCA1 sau BRCA2 sau tumori multi-focale sau multi-centrice sau care au fost supuși terapiei neoadjuvante sau au avut un istoric anterior de cancer. Pentru pacienții cu cancer mamar invaziv, au fost incluși doar cei cu specimene care adăpostesc țesut adipos imediat adiacent („tumoră adiacentă”) și> 4 cm distanță („distanță”) de tumora invazivă.

Analiza expresiei genelor

Pentru fiecare specimen de țesut adipos, s-a realizat o lamelă colorată cu hematoxilină și eozină (H&E) urmând proceduri standard (Fig. 2) și apoi s-au tăiat 10-20 secțiuni seriale (10 μm grosime), montate pe lamele de sticlă PEN (Leica Microsystems, 11505158) și colorate folosind kitul de colorare LCM (Life Technologies Corporation, AM1935) așa cum s-a descris anterior. 34 Utilizând evaluarea microscopică a H&E, au fost alese zone pentru țesutul adipos lipsit de leziuni tumorale sau pre-maligne, vase de sânge și alte componente stromale pentru microdisecția cu laser. Microdisecția cu laser a fost efectuată folosind un ASLMD sistem de microdisecție cu laser. Pregătirea diapozitivelor, colorarea și microdisecția fiecărei secțiuni au fost efectuate în decurs de 15 minute pentru a păstra integritatea ARN. ARN pentru analiza microarray a fost procesat așa cum s-a descris anterior. 35 ARN etichetat a fost hibridizat cu matrice HG U133A 2.0 (Affymetrix, 900469) conform protocoalelor producătorului.

Publicat online:

Figura 2. H&E a colorat imagini ale țesutului adipos adiacent și îndepărtat al tumorii de la un pacient cu cancer mamar invaziv. Imaginea din stânga este țesut adipos adiacent unui ER +/PR -/HER2 -, IDCA moderat diferențiat. Imaginea din dreapta este țesut adipos îndepărtat situat la 4 cm de tumoare.

Figura 2. H&E a colorat imagini ale țesutului adipos adiacent și îndepărtat al tumorii de la un pacient cu cancer mamar invaziv. Imaginea din stânga este țesut adipos adiacent unui ER +/PR -/HER2 -, IDCA moderat diferențiat. Imaginea din dreapta este țesut adipos îndepărtat situat la 4 cm de tumoare.