ABSTRACT
INTRODUCERE
Terapia antiretrovirală foarte activă (TARGA) a fost asociată cu dezvoltarea așa-numitului „sindrom lipodistrofic” (LD) (1-3). În cohorte cu utilizare predominantă a analogilor timidinei (TA), procentul pacienților seropozitivi diagnosticați ca lipodistrofici a atins nivelul de aproape 50% (1). Prevalența LD rămâne o problemă majoră în medicina HIV, având în vedere că analogii timidinei sunt încă foarte folosiți în țările cu resurse limitate (3, 4) și că lipoatrofia demonstrează doar o reversibilitate redusă după înlocuirea analogilor timidinei.
Pierderea periferică de grăsime ca parte a sindromului lipodistrofiei a fost legată în principal de utilizarea analogilor nucleozidici, în special a stavudinei (d4T) și a zidovudinei (AZT) (5, 6). Țesutul adipos abdominal subcutanat de la pacienții infectați cu HIV-1 cu lipoatrofie periferică a fost caracterizat printr-un nivel crescut de apoptoză (7, 8) și expresia afectată a markerilor adipogeni (9). Se presupune că perturbarea adipogenezei legată de medicament în combinație cu pierderea crescută a celulelor ar duce la atrofia țesutului adipos. Folosind linii celulare bine caracterizate și adipocite umane primare, noi și alții au confirmat în mod repetat proprietățile antiadipogene ale AZT și d4T in vitro (10-15), care ar putea avea un impact clinic asupra adipogenezei in vivo (16).
O serie de studii recente au sugerat un rol central al autofagiei adipocitelor în menținerea homeostaziei țesutului adipos (19-21). Inhibarea genetică și farmacologică a autofagiei adipocitelor a fost legată mecanic de scăderea masei adipoase și de afectarea adipogenezei (19-21).
Deoarece efectele in vivo și in vitro ale tratamentului AZT și d4T ale homeostaziei adipocitelor amintesc de o situație în care echilibrul autofagic este compromis, am emis ipoteza că unele dintre efectele antiadipogene ale acestor medicamente ar putea fi mediate prin impactul lor asupra autofagiei.
MATERIALE ȘI METODE
Inhibarea genetică a autofagiei a fost realizată prin eliminarea ATG5 (shATG5) mediată de ARN cu ac de păr (shRNA) (Santa Cruz). ATG5 codifică o proteină autofagică critică necesară pentru maturarea membranei autofagice (19). CopGFP și ARNs nespecific au fost utilizate ca martori conform instrucțiunilor producătorului (Santa Cruz). Transducția și eliminarea s-au efectuat prin utilizarea particulelor lentivirale cu până la cinci constructe de expresie distincte. Eficiența transducției determinată de numărul de celule GFP-pozitive după selecția puromicinei a depășit în general 95%.
Analiza efectelor inhibitorilor nucleozidici de transcriptază inversă (INRT) asupra activității autofagice celulare. O considerație esențială în analiza autofagiei celulare este faptul că autofagozomii corespund unei structuri intermediare a unui proces dinamic și că cantitatea lor totală la un anumit punct de timp este o funcție a două variabile: generație versus dispariție (18). Prin urmare, o creștere a prezenței autofagozomilor ar putea însemna fie inducerea, fie blocarea autofagiei tardive (la un pas în aval de formarea autofagozomilor [AF]). Măsurarea fluxului autofagic permite discriminarea între aceste două scenarii (18).
Analiza cu microscopie fluorescentă a efectului NRTI asupra formării autofagozomilor. GFP-LC3 a fost vizualizat utilizând microscopia convențională cu fluorescență în conformitate cu liniile directoare recent actualizate (18). Rezerva citoplasmatică GFP-LC3 a fost detectată ca un semnal dispersat omogen, în timp ce autofagozomii marcați GFP-LC3-II au fost vizualizați ca formațiuni de puncte (18). Formarea artefactelor experimentale ca rezultat al potențialelor agregate voluminoase GFP-LC3 a fost minimizată prin utilizarea celulelor transduse stabil în combinație cu selecția clonă adecvată (18).
Pentru experimente cu imagistica a celulelor vii, celulele 293T și 3T3-F442A care exprimă stabil GFP-LC3 au fost crescute pe lamele de sticlă. Celulele au fost supuse incubațiilor desemnate la 37 ° C în 5% CO2. Pentru fiecare condiție separată de tratament, au fost preluate imagini de fluorescență de la mai multe celule aparținând unui număr de câmpuri alese aleatoriu cu un filtru GFP folosind un instrument Olympus IX81 și analySIS (Soft Imaging System GmbH).
Analize citometrice în flux ale activității autofagice. Pentru a măsura fluxul autofagic, am profitat de un test citometric de flux recent dezvoltat pentru a monitoriza autofagia în celulele vii de mamifere (18). Această metodă cantitativă extrem de sensibilă se bazează pe monitorizarea cifrei de afaceri a markerului autofagosomal tradițional LC3 marcat cu GFP folosind citometrie de flux. Activarea și inhibarea activității autofagice sunt detectate corespunzător ca o scădere sau creștere dependentă de timp a semnalului total GFP celular (18). Activarea autofagiei intensifică livrarea GFP-LC3 în autolizozomi, ducând la degradarea și dispariția selectivă a semnalului GFP (18). Inhibarea autofagiei, pe de altă parte, are ca rezultat un blocaj al fluxului autofagic, ducând la acumularea GFP-LC3 și, prin urmare, la o creștere a semnalului fluorescent (18). Inhibarea autofagiei a fost, de asemenea, studiată prin măsurarea capacității NRTI de a inversa dispariția indusă de activator a semnalului de fluorescență GFP-LC3 (18).
Analiza citometrică de flux a activității autofagice a celulelor 293T și 3T3-F442A a fost măsurată, deoarece celulele subconfluente care exprimă stabil GFP-LC3 au fost incubate în condiții diferite. Celulele au fost tripsinizate, puse pe gheață și analizate folosind fie FACSCalibur, fie LSR II (Becton, Dickinson Biosciences) și datele numărului de celule reprezentate ca intensitate a fluorescenței GFP.
Colorarea lipidelor intracelulare. Pentru colorarea cu ulei roșu O (Sigma-Aldrich, München, Germania), celulele aderente 3T3-F442A au fost formaldehidă (10%) fixate, spălate și colorate cu o soluție de 0,21% (greutate/vol) roșu ulei O (60% izopropanol, 40% apă). Cuantificarea conținutului de triacilgliceride a fost efectuată după uscarea celulelor și extracția roșu de ulei O cu izopropanol 100% urmată de măsurare fotometrică la 495 nm.
Statistici. Evaluarea statistică pentru comparații a mai mult de două grupuri a fost realizată prin analiza varianței (ANOVA) cu analiza Dunnett post hoc. Nivelul de semnificație a fost stabilit la P AZT și d4T cresc acumularea de autofagozomi indusă de PP242. Analiza prin microscopie cu fluorescență a celulelor care exprimă în mod stabil LC3-GFP detectează autofagozomi ca formațiune de puncte pe fundalul modelelor LC3-GFP distribuite omogen. Inducția autofagică este detectată ca acumulare de puncte autofagice. În condițiile care duc la activarea autofagică, inhibarea timpurie a proceselor autofagice poate fi identificată prin incapacitatea celulei de a forma puncte autofagice. În schimb, inhibarea tardivă a autofagiei este de așteptat să conducă la acumularea suplimentară de autofagozomi.
Pentru a extinde analiza noastră și pentru a distinge mai bine între inducerea autofagiei și inhibarea maturării autofagozomului, am cultivat celule 293T exprimând stabil LC3-GFP în prezența sau absența concentrațiilor crescânde de AZT, d4T și 3TC timp de până la 72 de ore cu și fără înfometare. Incubația cu mediu de înfometare și rapamicină (5 μM) timp de 6 ore a fost inclusă ca un control pozitiv pentru activarea autofagiei și cu 3-MA, wortmannin și LY294002 timp de 6 ore pentru inhibarea autofagiei. Analiza noastră citometrică de flux a demonstrat că AZT și d4T, dar nu și 3TC, suprimă activitatea autofagică 293T într-o manieră dependentă de doză (Fig. 2A). În plus, a existat o inversare evidentă legată de doză a activării mediată de înfometare a fluxului autofagic în culturi coincubate cu AZT și d4T, dar nu și 3TC, similar cu efectul 3-MA, wortmannin și LY294002 (Fig. 2B). Foarte important, reversia dependentă de timp a activării fluxului autofagic indusă de înfometare a fost ușor detectată la concentrațiile terapeutice de Cmax ale AZT și d4T (Fig. 2C).
AZT și d4T inhibă autofagia adipocitelor. Celulele 3T3-F442A au fost incubate cu AZT (6 μM) și d4T (3 μM) timp de 24 h și 3-MA (10 mM) sau nocodazol plus vinblastină (25 μM) timp de 6 h în prezența și absența PP242 (5 μM ) în ultimele 4 ore. (A) Analiza prin microscopie fluorescentă a formării punctelor autofagice în celulele 3T3-F442A care exprimă stabil proteina de fuziune LC3-GFP. (B) Analiza prin citometrie de flux a fluxului autofagic al celulelor 3T3-F442A incubate în absența sau prezența AZT (150 μM) și a d4T (75 μM) timp de 32 de ore cu și fără PP242 în ultimele 6 ore. (C) Analiza prin citometrie de flux a fluxului autofagic al celulelor 3T3-F442A incubate în absența sau prezența nocodazolului (50 μM), vinblastinei (50 μM) sau clorurii de amoniu (20 mM) cu și fără PP242 timp de 6 ore.
Pentru analiza citometrică în flux, celulele LC3-GFP 3T3-F442A au fost incubate în prezența sau absența concentrațiilor crescânde de AZT, d4T și 3TC timp de până la 72 de ore. În experimente separate, incubațiile cu nocodazol, vinblastină și ACH au fost utilizate ca martori pozitivi pentru inhibarea tardivă a autofagiei. La concentrații mari, AZT și d4T inhibaseră deja fluxul autofagic 3T3-F442A după 32 de ore și inversaseră efectul activării induse de PP242 (Fig. 3B). Efecte similare asupra fluxului autofagic în adipocite au fost detectate în culturile tratate cu nocodazol, vinblastină sau ACH (Fig. 3C). După 72 de ore de incubație a medicamentului, AZT și d4T, dar nu și 3TC, doza autofagie inhibată în mod dependent în celulele 3T3-F442A (Fig. 4A). Acest efect a fost paralel cu o scădere a proliferării celulare (Fig. 4B) și o creștere a morții celulare (Fig. 4C). Foarte important, efecte similare asupra proliferării celulei 3T3-F442A și a viabilității celulare au fost observate folosind inhibiția farmacologică (Fig. 4D) sau genetică (date neprezentate) ATG5 inhibarea knockdown a autofagiei.
DISCUŢIE
HAART a fost asociat cu dezvoltarea LD caracterizată prin evenimente adverse severe, cum ar fi redistribuirea grăsimilor, dislipidemie, rezistență la insulină și diabet zaharat (1-3). Pierderea de grăsime periferică ca parte a acestui sindrom a fost în cea mai mare parte legată de utilizarea d4T și AZT (5, 6, 31).
Țesutul adipos abdominal subcutanat de la pacienții infectați cu HIV-1 cu lipoatrofie periferică pe tratament cu NRTI (predominant d4T) a fost caracterizat prin exprimarea afectată a markerilor adipogeni (9) și niveluri mai ridicate de apoptoză (8, 32). Ca rezultat, adipogeneza compromisă cu rate crescute de moarte celulară a fost propusă ca unul dintre mecanismele patogene ale lipoatrofiei mediate de NRTI (9). Mai mult, diferențierea afectată cu niveluri crescute de apoptoză a fost confirmată în mod repetat in vitro ca urmare a incubației AZT și d4T (10-13, 15).
Calea degradării lizozomale a autofagiei a fost implicată în reglarea supraviețuirii, dezvoltării și diferențierii celulare (17). În timpul procesului, se formează vezicule cu membrană dublă numite autofagozomi în care organele și citoplasma sunt sechestrate pentru fuziunea ulterioară cu lizozomii și degradarea ulterioară a conținutului (17). Recent, autofagia adipocitelor a fost implicată în menținerea homeostaziei țesutului adipos (19-21). Inhibarea genetică și farmacologică a autofagiei adipocitelor a fost asociată cu scăderea acumulării de lipide, producția afectată a markerilor adipogeni și compromiterea conversiei adipogene in vitro care s-a tradus în scăderea masei țesutului adipos alb în mai multe modele in vivo de șoarece knockout specifice adipocitelor (19-21). În unele dintre aceste studii, afectarea autofagiei a conversiei adipogene a fost însoțită de apoptoză celulară excesivă (19). Studiile nonadipocite, pe de altă parte, au stabilit o legătură mecanicistă între autofagia defectă, acumularea disfuncțională a mitocondriilor cu formarea crescută a ROS și inițierea căii intrinseci a apoptozei (26-29).
Aici raportăm că AZT și d4T, dar nu și 3TC, au un efect direct de supresie atât asupra autofagiei de bază, cât și a celei activate farmacologic și fiziologic. Aceste efecte au fost dependente de doză și de timp și au fost observate la Cmax terapeutice. Faptul că AZT și d4T nu au interferat cu stadiile precoce ale autofagiei de formare a autofagozomilor și efectul puternic inhibitor asupra fluxului autofagic în combinație cu acumularea substanțială de autofagozomi sugerează un mecanism de inhibare a autofagiei în aval de formarea autofagozomilor.
Există anumite limitări privind simularea in vitro în situații clinice. Efectele adverse legate de HAART necesită, în general, tratament prelungit (de câteva luni) (1, 3, 33), iar profilurile farmacocinetice specifice ar putea influența toxicitatea clinică (34). Cu toate acestea, condiții experimentale similare au fost utilizate în mod repetat în analizele anterioare in vitro ale efectelor NRTI asupra adipogenezei și au oferit rezultate în acord cu datele clinice (10-13, 15). În concordanță cu aceasta, rezultatele noastre au arătat că doar d4T și AZT (5, 6) au suprimat autofagia adipocitelor, proliferarea, diferențierea și viabilitatea, în timp ce 3TC nu a avut astfel de efecte. Sunt necesare studii suplimentare pentru a evalua impactul altor medicamente antiretrovirale asupra autofagiei. În cele din urmă, inhibarea farmacologică a autofagiei prin utilizarea compușilor precum vinblastina, clorochina și alții poate duce la efecte în afara obiectivelor. Astfel, aceste date trebuie interpretate cu precauție și ar trebui să fie văzute împreună cu rezultatele noastre după suprimarea mai specifică a autofagiei mediată de shRNA.
Având în vedere asocierea puternică dintre autofagie și îmbătrânire (17), rezultatele noastre pot fi relevante pentru asocierea recent descoperită dintre tratamentul NRTI și îmbătrânirea mitocondrială accelerată cu acumularea de mutații ADN mitocondrial (mtDNA) la pacienții cu HIV (41), ca autofagie defectă în sine a fost implicat în generarea de mitocondrii disfuncționale, creșterea producției de ROS și acumularea mutațiilor ADNmt (29). În cele din urmă, s-a dovedit că d4T și AZT, dar nu și 3TC, declanșează un program de senescență prematură în fibroblastele pielii umane și preadipocite 3T3-F442A (11), iar expresia ridicată a factorilor de senescență a fost documentată în probe de țesut adipos subcutanat de la pacienți lipodistrofici HIV-pozitivi pe regimente care conțin NRTI (11).
În concluzie, experimentele noastre demonstrează un efect inhibitor dependent de doză și de timp al AZT și d4T asupra autofagiei adipocitelor la concentrații terapeutice ale medicamentului Cmax. Aceste efecte s-au corelat cu moartea celulară crescută, proliferarea redusă și diferențierea afectată. Având în vedere că autofagia este implicată în reglarea masei adipoase și diferențierea (19-21), precum și în îmbătrânire (17) și luând în considerare risipa de grăsime periferică (5, 6, 31) și fenotipul de îmbătrânire prematură a unor pacienți cu HIV (42), aceste descoperiri ar putea fi relevante pentru o mai bună înțelegere și evitarea toxicității pe termen lung a medicamentelor antiretrovirale.