Pham Anh Tuan

1 Departamentul de Științe ale Culturilor, Colegiul de Agricultură și Științe ale Vieții, Universitatea Națională Chungnam, 79 Daehangno, Yuseong-gu, Daejeon, 305-764, Coreea

Jae Kwang Kim

2 Academia Națională de Științe Agricole, Administrația Dezvoltării Rurale, Suwon 441-707, Coreea

Jeongyeo Lee

3 Green Bio Research Center, Cabbage Genomics assisted reproducere asistat Centrul, Coreea Institutul de Cercetare a Bioscience și Biotehnologie (KRIBB), Daejeon 305-806, Korea

Parcul Woo Tae

1 Departamentul de Științe ale Culturilor, Colegiul de Agricultură și Științe ale Vieții, Universitatea Națională Chungnam, 79 Daehangno, Yuseong-gu, Daejeon, 305-764, Coreea

Pentru Yeon Kwon

1 Departamentul de Științe ale Culturilor, Colegiul de Agricultură și Științe ale Vieții, Universitatea Națională Chungnam, 79 Daehangno, Yuseong-gu, Daejeon, 305-764, Coreea

Yeon Bok Kim

1 Departamentul de Științe ale Culturilor, Colegiul de Agricultură și Științe ale Vieții, Universitatea Națională Chungnam, 79 Daehangno, Yuseong-gu, Daejeon, 305-764, Coreea

Haeng Hoon Kim

4 Departamentul de resurse pentru bunăstare, Universitatea Națională Sunchon, 413 Jungangno, Suncheon, Jeollanam-do, 540-742, Coreea

Hye Ran Kim

3 Green Bio Research Center, Cabbage Genomics assisted reproduction reproduction Centre, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Daejeon 305-806, Korea

Parcul Sang Un

1 Departamentul de Științe ale Culturilor, Colegiul de Agricultură și Științe ale Vieții, Universitatea Națională Chungnam, 79 Daehangno, Yuseong-gu, Daejeon, 305-764, Coreea

Abstract

Relația dintre acumularea carotenoidelor și expresia genelor de biosinteză a carotenoidelor a fost investigată în flori, tulpini, frunze tinere, frunze vechi și rădăcini de varză chineză (Brassica rapa subsp. Pekinensis). Analiza PCR cantitativă în timp real a arătat că nivelurile de ARNm de BrPSY, BrPDS, BrZDS, BrLCYB, BrLCYE, BrCHXB și BrZEP care au condus la producția de carotenoizi au fost cele mai mari în flori sau frunze și cele mai mici în rădăcinile varzei chineze În schimb, expresia mARN a BrNCED, o genă implicată în biosinteza acidului abscisic (ABA), a fost cea mai ridicată în rădăcini. Cromatografia lichidă de înaltă performanță a arătat că carotenoizii, și anume, luteina și β-carotenul, au fost distribuiți predominant în flori și frunze, cu foarte puțin în organul subteran, rădăcini. Mai exact, frunzele vechi conțineau 120,3 μg/g luteină și 103,93 μg/g β-caroten, care este cel mai puternic precursor alimentar al vitaminei A. Mai mult, am găsit o cantitate relativ mare de izomeri cis ai β-carotenului, și anume 9- cis β-caroten și 13-cis β-caroten, în varza chineză. Aceste rezultate oferă o perspectivă asupra mecanismelor biosintetice carotenoide din varza chineză și pot fi utile în ingineria metabolică a biosintezei carotenoide la plante.

Abrevieri

DEPC, dietilpirocarbonat; HPLC, cromatografie lichidă de înaltă performanță; GGDP, difosfat de geranilgeranil; PSY, fitoen sintază; PDS, fitoene desaturază; ZDS, ξ-caroten desaturază; LCYB, licopen β-ciclază; LCYE, licopen ε-ciclază; CHXB, β-inel caroten hidroxilază; CHXE, ε-inel caroten hidroxilază; ZEP, zeaxantin epoxidază; NCED, 9-cis epoxicarotenoid dioxigenază; ABA, acid abscizic; Frunze Y, frunze tinere; O-frunze, frunze vechi

Introducere

acumulării

Varza chineză (Brassica rapa subsp. Pekinensis) este originară din China și este una dintre cele mai cultivate legume din Asia. Prin urmare, varza chineză a făcut obiectul multor cercetări în încercarea de a evalua compușii săi nutritivi (Artemyeva și Solovyeva, 2006 [1]; Krumbein și colab., 2005 [19]). Acest studiu a fost întreprins pentru a investiga acumularea carotenoidelor și expresia genelor legate de biosinteza carotenoidelor în flori, tulpini, frunze tinere, frunze vechi și rădăcini de varză chineză, pentru a clarifica mecanismul de biosinteză carotenoidă și valoarea nutrițională a acestei plante.

Materiale și metode

Materiale vegetale

Varza chineză a fost cultivată într-o seră la ferma experimentală a Universității Naționale Chungnam (Daejeon, Coreea). Florile, tulpinile, frunzele tinere, frunzele vechi și rădăcinile au fost excizate de la plante mature. Probele au fost imediat congelate în azot lichid și apoi depozitate la -80 ° C pentru izolarea ARN-ului sau liofilizate pentru analiza cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC).

Analiza expresiei prin PCR în timp real

ARN-ul total a fost extras separat din fiecare organ al plantei de varză chineză, folosind planta de kit mini ARN total (Geneaid, Taiwan). Calitatea și concentrația de ARN au fost determinate prin electroforeză pe gel de agaroză și respectiv prin spectrofotometrie. ADNc monocatenar a fost sintetizat folosind kitul ReverTra Ace-α (Toyobo, Osaka, Japonia), conform protocolului producătorului. O diluție de 25 de ori a ADNc rezultat a fost utilizată pentru PCR în timp real.

Pe baza informațiilor secvențiale găsite în Genbank, am folosit Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3) pentru a proiecta primeri pentru a amplifica următoarele gene de biosinteză carotenoidă din varza chineză: BrPSY, BrPDS, BrZDS, BrLCYB, BrLCYE, BrCHXB, BrZEP și BrNCED (Tabelul 1 (Tab. 1)). Gena Actin a fost utilizată ca genă de menaj. Curbele de topire și pragurile de ciclu pentru fiecare pereche de primer PCR în timp real au fost examinate cu atenție înainte de utilizare. PCR în timp real a fost realizat într-un volum de reacție de 20 uL conținând 0,5 uM primer (fiecare) și 1 × SYBR Green Real-time PCR Master Mix (Toyobo). Reacția PCR în timp real a fost repetată independent de 3 ori și analizată de software-ul Bio-Rad CFX Manager 2.0 (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA, SUA). Condițiile PCR au fost de 94 ° C timp de 5 minute; 94 ° C timp de 15 s, temperatura de recoacere de 56 ° C timp de 15 s și 72 ° C timp de 2 s timp de 40 de cicluri.

Extracția și analiza carotenoizilor

Carotenoidele au fost extrase din probe de varză chineză (1 g) cu 30 ml etanol conținând 0,1% acid ascorbic (g/v). Acest amestec a fost agitat timp de 20 de secunde, apoi incubat într-o baie de apă la 85 ° C timp de 5 minute. Ulterior, s-au adăugat 120 uL de hidroxid de potasiu (80% g/v) pentru a saponifica orice uleiuri potențial interferente. După vortexare și incubare la 85 ° C timp de 10 min, probele au fost plasate pe gheață și 1,5 mL de apă rece deionizată și 0,05 mL de β-Apo-8'-carotenal (12,5 µg mL -1), un standard intern, au fost adaugate. Apoi, carotenoizii au fost extrasați de două ori cu 1,5 ml hexan și centrifugați la 1200 g de fiecare dată pentru a separa straturile. Apoi, extractele au fost liofilizate sub un curent de azot gazos și resuspendate în 50:50 (v/v) diclormetan/metanol. Metoda de extracție utilizată pentru analiza carotenoidelor a fost similară cu cea descrisă anterior (Howe și Tanumihardjo, 2006 [13]).

Pentru analiza HPLC, carotenoizii au fost separați pe un sistem HPLC Agilent 1100 cu o coloană C30 YMC (250 × 4,6 mm, 3 m; Waters Corporation, Milford, MA) și detectați cu un detector de matrice de fotodiodă (PDA) la 450 nm. Solventul A consta din metanol/apă (92: 8 v/v) cu acetat de amoniu 10 mM. Solventul B a constat din 100% metil terț-butil eter (MTBE). Debitul a fost menținut la 1 ml · min -1, iar probele au fost eluate cu următorul gradient: 0 min, 83% A/17% B; 23 min, 70% A/30% B; 29 min, 59% A/41% B; 35 min, 30% A/70% B; 40 min, 30% A/70% B; 44 min, 83% A/17% B; și 55 min, 83% A/17% B. Identificarea și atribuirea de vârf a carotenoizilor s-au bazat în principal pe compararea timpului lor de retenție și a datelor spectrului vizibil la UV cu cel al standardelor și cu liniile directoare prezentate anterior (Fraser și colab., 2000 Howe și Tanumihardjo, 2006 [13]).

Rezultate si discutii

Exprimarea genelor de biosinteză carotenoidă în diferite organe de varză chineză

Expresia genelor de biosinteză carotenoidă a fost investigată în flori, tulpini, frunze tinere, frunze vechi și rădăcini de varză chineză prin PCR în timp real (Figura 2 (Fig. 2)). Începând de la începutul căii de biosinteză carotenoidă, BrPSY a fost extrem de exprimat în flori, frunze tinere și frunze vechi; exprimat moderat în tulpini; și slab exprimat în rădăcini. La fel ca BrPSY, transcrierea BrPDS, BrZDS și BrLCYB a fost abundentă în flori și frunze și scăzută în rădăcini. Spre deosebire de licopenul β-ciclază (BrLCYB), licopenul ε-ciclază (BrLCYE) a fost exprimat foarte mult numai în flori, cu o expresie relativ mai mică în celelalte organe. Transcrierea BrCHXB a fost abundentă în flori, intermediară în tulpini și slabă în frunze și rădăcini. Frunzele tinere și frunzele vechi au prezentat niveluri ridicate de transcriere BrZEP, în timp ce expresia din rădăcini a fost cea mai scăzută. Cea mai înaltă expresie a BrNCED, care este implicată în biosinteza ABA, a fost văzută la rădăcini, unde ABA poate fi produsă ca răspuns la mediu (Fujita și colab., 2006 [8]; Zhu, 2002 [35]).

Analiza acumulării de carotenoizi în diferite organe de varză chineză

În studiul de față, expresia genelor de biosinteză carotenoidă a fost analizată în diferite organe de varză chineză. Cu excepția BrNCED, care este implicat în biosinteza ABA, genele au fost exprimate toate în mod constitutiv, cu cel mai înalt nivel în flori sau frunze și cel mai mic, în rădăcini. Acest lucru ar putea explica acumularea mare de carotenoizi în florile și frunzele de varză chineză. Carotenoizii distribuie în principal organele expuse la lumina directă (flori, tulpini și frunze), sugerând că lumina joacă un rol în acumularea de carotenoizi în varza chineză. Acest lucru este similar cu studiile anterioare efectuate pe alte plante în care nivelurile de carotenoizi au fost foarte scăzute în organele subterane (rădăcini), dar destul de ridicate în flori și frunze (Tuan și colab., 2011 [31] [30]). Există foarte puține specii de plante care sintetizează și acumulează niveluri ridicate de carotenoizi în rădăcini, cum ar fi morcovul și cartofii dulci (Fuentes și colab., 2012 [7]; Zhou și colab., 2011 [34]). Până în prezent, unele studii au arătat că biosinteza carotenoidelor la plante este puternic reglementată de lumină; cu toate acestea, mecanismele sunt încă neclare (Pizarro și Stange, 2009 [26]).

Frunzele de varză chineză conțin cantități semnificative de luteină și β-caroten, compuși care pot reduce riscul de accident vascular cerebral, boli de inimă și cancer (Kritchevsky, 1999 [18]; Mayne, 1996 [22]). Studiile epidemiologice sugerează că o dietă bogată în carotenoizi este asociată cu un risc redus de boli de inimă și cancer (Melendez-Martinez și colab., 2004 [23]). Cu toate acestea, tratarea fumătorilor cu β-caroten sintetic all-trans nu a demonstrat nicio reducere a incidenței cancerului pulmonar și nu a reușit să afecteze cancerul și bolile cardiovasculare (Hennekens și colab., 1996 [12]; Group, 1994 [29]). Mai mult, s-a demonstrat că o dietă bogată în 9-cis β-caroten inhibă aterogeneza și formarea ficatului gras la șoareci (Harari și colab., 2008 [10]). Am constatat că varza chineză are cantități relativ mari de 9-cis β-caroten și 13-cis β-caroten; cu toate acestea, mecanismul biosintetic al acestor izomeri cis ai β-carotenului este încă necunoscut la plante.

Mulțumiri

Această cercetare a fost susținută de Programul de dezvoltare tehnologică pentru agricultură și silvicultură (nr. 2011-1607), Ministerul Alimentației, Agriculturii, Silviculturii și Pescuitului, Republica Coreea.