Abstract

Introducere

Obezitatea și osteoporoza - asociate frecvent cu un stil de viață sedentar și malnutriție - câștigă din ce în ce mai mult atenția în societatea modernă, deoarece ambele condiții au potențialul de a provoca consecințe grave legate de sănătate. Deși sunt de obicei considerate separat, aceste două tulburări par a fi strâns legate (Goulding și colab. 2005). Cu toate acestea, nu există un consens cu privire la relația dintre obezitate și osteoporoză, în ciuda multor literaturi înrudite (Reid și colab. 1994; Ionova-Martin și colab. 2010). În mod tradițional, obezitatea este considerată favorabilă formării osoase și, astfel, protejează împotriva osteoporozei. Încărcarea mecanică conferită de greutatea corporală crescută stimulează formarea oaselor prin creșterea proliferării și diferențierii osteoblastelor și osteocitelor locale, precum și prin scăderea apoptozei celulelor genealogice osteoblastice prin calea de semnalizare Wnt/β-catenină (Patsch și colab. 2011). Studiile clinice au arătat că greutatea corporală sau indicele de masă corporală (IMC) este corelat pozitiv cu densitatea minerală osoasă sau masa osoasă, în timp ce greutatea corporală mică sau un IMC scăzut este un factor de risc pentru masa osoasă scăzută și pierderea osoasă la om (Felson și colab. 1993; Ravn și colab. 1999; Reid 2002).

Rapoarte recente au demonstrat că obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi este o cauză a pierderii osoase și poate fi considerată un factor de risc pentru osteoporoză (Jelcic 2010; Russell și colab. 2010). Un studiu transversal pe 200 de tineri cu vârste cuprinse între 3 și 19 ani a arătat că adipozitatea crescută poate fi legată de un risc crescut de fractură osoasă (Goulding și colab. 2001). Un alt studiu transversal amplu pe 13.000 de bărbați și femei adulți a indicat, de asemenea, o asociere pozitivă între procentul de grăsime corporală și osteopenie (Pollock și colab. 2007). În studiile efectuate pe animale, șoarecii obezi induși în dietă cu conținut ridicat de grăsimi au demonstrat afectarea microarhitecturii osoase și a proprietăților mecanice, împreună cu resorbția osoasă îmbunătățită și formarea osteoclastelor (Halade și colab. 2010; Halade și colab. 2011; Patsch și colab. 2011). Deși au fost propuse mai multe mecanisme potențiale implicate în stimularea osteoclastogenezei legată de obezitate, inclusiv inflamația de grad scăzut asociată adipocitelor acumulate (Halade și colab. 2011) și modificările hormonilor derivați ai țesutului adipos (Ducy și colab. 2000; Wang și colab. al. al. 2014), mecanismele precise care stau la baza asocierii dintre obezitate și os nu sunt încă bine elucidate.

Având în vedere implicarea obezității induse de o dietă bogată în grăsimi în metabolismul osos, am postulat că o dietă bogată în grăsimi ar putea modifica, într-o oarecare măsură, anomaliile asociate cu un fenotip osos indus de deficiența de IL-6. Pentru a confirma această speculație, am efectuat un studiu histologic asupra tibiilor șoarecilor knockout IL-6 hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi sau dietă normală.

Materiale și metode

Animale și diete

H&E Colorare și histomorformetrie osoasă

Colorarea H&E a fost efectuată pentru a investiga morfologia metafizelor la șoareci din cele patru grupuri. Au fost observate secțiuni colorate și imagini digitale au fost luate cu microscopul cu lumină (Olympus BX-53; Tokyo, Japonia). Software-ul Image-Pro Plus (versiunea 6.2; Media Cybernetics, Rockville, MD) a fost utilizat pentru măsurarea parametrilor histomorfometriici ai osului, inclusiv volumul osos trabecular (BV/TV, volumul osos/volumul țesutului × 100%), numărul trabecular (Tb.N), grosimea trabeculară (Tb.Th) și separarea trabeculară (Tb.Sp). Opt felii pentru fiecare probă au fost utilizate pentru analiza histomorfometrică cantitativă pentru a obține valoarea medie.

Adipocitele vizibile (> 30 μm în diametru) au fost, de asemenea, numărate în regiunea trabeculară (adică, de la placa de creștere la 2 mm distal) folosind un microscop cu lumină (Olympus BX-53).

Imunohistochimie pentru fosfataza alcalină, osteocalcina, catepsina K și colorarea fosfatazei acide rezistente la tartrat

Testul apoptozei celulare

Apoptoza celulară a fost determinată folosind metoda deoxinucleotidil transferază mediată deoxiuridin trifosfat nick-label (TUNEL) folosind metoda TACS 2TdT-Blue Label In Situ Apoptosis Detection Kit (Trevigen Inc; Gaithersburg, MD). Secțiunile decerate au fost incubate cu 1% proteină K (Trevigen Inc.) diluate 1: 200 la 37 ° C timp de 15 min, urmate de inhibarea peroxidazelor endogene la temperatura camerei timp de 5 min. După tratamentul cu enzima TdT la o diluție de 1:50 la 37 ° C timp de 1 oră, secțiunile au fost incubate cu streptavidină HRP conjugată la temperatura camerei timp de 15 minute. Reacția a fost făcută vizibilă cu soluția de etichetă albastră furnizată în kit. Osteoclastele apoptotice au fost identificate ca fiind atât TUNEL cât și TRAP pozitive în același câmp vizual pe secțiuni seriale.

Analize statistice

Parametrii structurii osoase și densitatea optică integrată a ALP, OCN și CK, precum și numărul de osteoclaste/câmp au fost evaluate cu software-ul Image-Pro Plus. Toate valorile sunt prezentate ca medie ± deviație standard. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru compararea mai multor grupuri, iar valoarea medie a fiecărui grup a fost comparată folosind testul Student-Newman-Keuls (SNK). p -/- șoareci hrăniți cu SD și HFD, p Fig. 1). Pentru a confirma efectul unui HFD asupra adipogenezei în microambientul măduvei osoase, adipozitatea măduvei osoase a fost evaluată prin colorare H&E. Pe SD, șoarecii nu au prezentat diferențe semnificative în numărul sau dimensiunea adipocitelor între șoarecii IL-6 -/- și WT (Fig. 2A, 2C 2C și and2E). 2E). Pe HFD, numărul și dimensiunea adipocitelor au fost semnificativ crescute în comparație cu șoarecii martori respectivi hrăniți cu SD (Fig. 2B, 2D 2D și and2E). 2E). Acest lucru indică faptul că HFD îmbunătățește adipogeneza în micromediul măduvei osoase.

lung

Testul TUNEL al osteoclastelor în secțiuni tibiale și analiza statistică. (A, C, E, G) Distribuția celulelor multinucleate TRAP-pozitive situate la marginea osului trabecular la șoareci de la (A) WT & SD, (C) WT & HFD, (E) IL-6 -/- & SD, (G) IL-6 -/- și grupuri HFD. (B, D, F, H) Test TUNEL indicând corpuri apoptotice (albastru) în aceleași zone pentru (B) WT & SD, (D) WT & HFD, (F) IL-6 -/- & SD, (H )) IL-6 -/- & grupuri HFD. Săgețile indică osteoclastele apoptotice identificate la compararea secțiunilor seriale. (I) Analiza statistică a numărului de osteoclaste (apoptotice) în funcție de numărul total de osteoclaste. Datele sunt media ± SD; ** Șoarecii p -/- au prezentat microstructură osoasă anormală în tibiile lor, incluzând dezvoltarea întârziată a metafizei tibiale și prezența unui os trabecular mai abundent, mai gros, dar imatur, care a fost probabil cauzat de o reglare descendentă a activității osteoclastelor și o creșterea ratei lor de apoptoză (Liu și colab. 2014). În prezentul studiu, obezitatea indusă de HFD a fost stabilită la șoareci IL-6 -/- pentru a investiga efectul consumului pe termen lung al unui HFD asupra microstructurii osoase anormale induse de deficiența de IL-6. În plus față de creșterea semnificativ crescută a greutății corporale, hrănirea cu un HFD a normalizat fenotipul osos al șoarecilor IL-6 -/- la cel al controlului WT, caracterizat printr-un os cortical îngroșat și un os trabecular asemănător unei plăci dispuse oblic. În mod specific, activitatea de resorbție osoasă atenuată semnificativ și capacitatea de supraviețuire a osteoclastelor la șoareci IL-6 -/- au fost restaurate prin hrănirea cu un HFD, ceea ce poate explica gradul mai mare în care a fost restaurată microstructura osoasă anormală.

În studiul nostru anterior, șoarecii cu deficiență de IL-6 au prezentat osteoblastogeneză și formare osoasă semnificativ îmbunătățită, deoarece IL-6 inhibă diferențierea osteoblastelor (Franchimont și colab. 2005) și s-a demonstrat că scade expresia markerilor de diferențiere în osteoblasti (Yang și colab. 2007). În studiul de față, colorarea imunohistochimică pentru markerii osteogenezei a arătat că expresiile a doi markeri critici de diferențiere a osteoblastelor, ALP și OCN, au fost atenuate după hrănirea HFD în comparație cu colegii care au hranit cu SD. Acesta a fost în special cazul grupurilor IL-6 -/-, în care intensitatea colorării pentru ambii markeri osteogeni a fost redusă la cea a grupului WT & SD, indicând o inhibare a formării osoase de către obezitatea indusă de HFD. Este bine cunoscut faptul că adipocitele și osteoblastele sunt derivate dintr-o celulă stem mezenchimală multipotentă comună și că obezitatea poate crește adipogeneza în timp ce scade osteoblastogeneza (Rosen și Bouxsein 2006). Cu toate acestea, rezultatele noastre au demonstrat că masa osoasă a crescut la șoarecii WT hrăniți cu HFD, iar acest rezultat nu a reflectat capacitatea osteogenică afectată cauzată de adipogeneza exagerată. Această discrepanță ar putea fi explicată prin faptul că greutatea corporală crescută asociată cu obezitatea poate contracara efectele dăunătoare ale obezității asupra metabolismului osos, deoarece greutatea corporală sau indicele de masă corporală (IMC) este raportat a fi corelat pozitiv cu masa osoasă (Felson și colab. 1993; Reid 2002) și greutatea corporală scăzută sau IMC pot fi un factor de risc pentru masa osoasă scăzută la om (Ravn și colab. 1999).

În ceea ce privește osteoclastogeneza, colorarea TRAP nu a arătat nicio modificare semnificativă a numărului de osteoclaste în grupurile WT, ceea ce diferă de rezultatele altor câteva studii că depunerea grăsimilor în microambientul măduvei osoase stimulează formarea osteoclastelor și resorbția osoasă (Cao și colab. 2010; Halade și colab., 2011). Această inconsecvență poate fi cauzată de diferențele la animalele studiate în ceea ce privește vârsta, nivelurile de grăsime din dietă și timpul sau durata hrănirii cu HFD. Interesant este că osteoclastogeneza crescută pentru șoareci din grupul IL-6 -/- & SD (dovadă fiind numărul crescut de osteoclaste TRAP-pozitive) a fost semnificativ redusă după un HFD. Acest fenomen poate fi atribuit osteoblastogenezei inhibate de șoareci IL-6 -/- de către HFD, care atenuează osteoclastogeneza prin calea RANKL/RANK/OPG (Lacey și colab. 1998; Yasuda și colab. 1998).

În concluzie, rezultatele noastre arată că anomaliile microstructurii osoase induse de deficiența de IL-6 sunt parțial inversate de consumul pe termen lung al unui HFD. Această reabilitare a metabolismului osos poate fi realizată prin suprimarea osteoblastogenezei indusă de HFD, o reglare ascendentă a activității osteoclastice, precum și o inhibare a apoptozei osteoclastelor (Fig. 8). Sunt necesare cercetări suplimentare pentru a se concentra asupra mecanismului efectului sinaptic al deficitului de IL-6 combinat cu un HFD asupra metabolismului osos modificat.

Model schematic care prezintă rolurile obezității induse de HFD și ale eliminării IL-6 în remodelarea oaselor de șoarece. Deficitul de IL-6 îmbunătățește formarea osoasă prin promovarea osteoblastogenezei și suprimarea resorbției osoase printr-o inhibare a capacității și viabilității osteoclastice. În acest proces, creșterea osteoclastogenezei asociată cu osteoblastogeneza îmbunătățită prin calea RANKL/OPG nu poate compensa resorbția osoasă redusă care rezultă din scăderea activității osteoclastelor; acest lucru, împreună, duce la anomalii osoase observate la șoareci IL-6 -/-. Obezitatea indusă de HFD restabilește modificările care apar ca răspuns la deficitul de IL-6 printr-o inhibare a osteoblastogenezei și o creștere a acțiunii osteoclastelor, cum ar fi capacitatea de resorptie osteoclastică și viabilitatea celulară îmbunătățită. Aceste modificări contracarează efectele deficitului de IL-6 și astfel duc la apariția unui fenotip relativ normal în microstructura tibială la șoareci IL-6 -/-.

Note de subsol

Declarația contribuției autorului: WF și BL pentru achiziționarea datelor și redactarea articolului; YM și KO pentru animale și suport pentru anticorpi; TH pentru prelucrarea probelor; JC și DL pentru revizuirea articolului; WW și XH pentru analiza statistică; NA pentru concepție; ML pentru proiectare și revizuirea manuscriselor.

Interese concurente: Autorii nu au declarat potențiale interese concurente în ceea ce privește cercetarea, autorul și/sau publicarea acestui articol.

Finanțarea: Autorii au dezvăluit primirea următorului sprijin financiar pentru cercetarea, autorul și/sau publicarea acestui articol: Acest studiu a fost parțial susținut de Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (grant nr. 81271965; 81470719; 81311140173) și Fondul de cercetare specializată pentru programul de doctorat în învățământul superior (subvenția nr. 20120131110073) către Li M.