Departamente de * Anatomie și Biologie celulară, Colegiul de Medicină, Universitatea din Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canada

Mohammad Hossein Noyan - Ashraf și Lingyun Wu au contribuit în mod egal la această lucrare.

Farmacologie, Colegiul de Medicină, Universitatea din Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canada

Mohammad Hossein Noyan - Ashraf și Lingyun Wu au contribuit în mod egal la această lucrare.

Fiziologie, Colegiul de Medicină, Universitatea din Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canada

Departamente de * Anatomie și Biologie celulară, Colegiul de Medicină, Universitatea din Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canada

Autor corespondent: Bernhard H. J. Juurlink, Departamentul de Anatomie și Biologie Celulară, Colegiul de Medicină, 107 Wiggins Road, Universitatea din Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canada, S7N 5E5. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Departamente de * Anatomie și Biologie celulară, Colegiul de Medicină, Universitatea din Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canada

Mohammad Hossein Noyan - Ashraf și Lingyun Wu au contribuit în mod egal la această lucrare.

Farmacologie, Colegiul de Medicină, Universitatea din Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canada

Mohammad Hossein Noyan - Ashraf și Lingyun Wu au contribuit în mod egal la această lucrare.

Fiziologie, Colegiul de Medicină, Universitatea din Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canada

Departamente de * Anatomie și Biologie celulară, Colegiul de Medicină, Universitatea din Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canada

Autor corespondent: Bernhard H. J. Juurlink, Departamentul de Anatomie și Biologie Celulară, Colegiul de Medicină, 107 Wiggins Road, Universitatea din Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canada, S7N 5E5. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

ABSTRACT

Rees a subliniat că soluțiile clinice pentru bolile complexe pot fi adesea destul de simple (1). Programarea fetală a sănătății adulților pare a fi o oportunitate majoră pentru prevenirea bolilor (2). Studiile epidemiologice la om și experimentarea pe animale au arătat că afecțiunile adverse experimentate în timpul creșterii intrauterine pot crește incidența bolilor precum diabetul de tip 2, hipertensiunea arterială, ateroscleroza și cancerul (2). O îngrijorare și mai mare este că se acumulează dovezi ale efectelor intergeneraționale ale programării fetale (3). Mulți dintre factorii care contribuie la programarea fetală negativă a sănătății adulților cauzează stres oxidativ crescut și inflamație (4). Stresul oxidativ este locul în care există un dezechilibru între producția de oxidant și eliminarea. Glutationul tiol mic (GSH) joacă un rol central în eliminarea oxidantului (5), raportul dintre GSH și glutation oxidat (GSSG) fiind o bună măsură a stresului oxidativ general.

Am emis ipoteza că plasarea SHRsp feminină pe aceeași dietă care conține glucozinolat ca în studiul nostru anterior nu numai că va reduce stresul oxidativ și hipertensiunea arterială și inflamația asociate la femela însăși, dar ar duce și la rezultate mai bune asupra sănătății descendenților acestor femele.

MATERIALE ȘI METODE

Pregatirea varza de broccoli

Semințele de broccoli din soiul Calabrese, obținute din Mumm's Seeds și Sprouting (Shellbrook, SK, Canada), au fost încolțite conform instrucțiunilor furnizorului. Varza de broccoli în vârstă de patru zile a fost uscată la aer la temperatura camerei timp de 7 zile înainte de a fi hrănită animalelor. Conținutul de glucozinolat și activitățile de inducere a proteinelor de fază 2 ale mugurilor uscați au fost descrise anterior (14). Lăstarii uscați la aer au 27,3 μmol echivalenți sulforaphane în activitatea de inducere a proteinelor de fază 2 pe gram de lăstari uscați, cea mai mare parte a acestei activități derivând în cele din urmă de glucorafanină.

Modelul animal și dieta

Am folosit SHRsp masculin și feminin (obținut inițial de la NIH și menținut de Facultatea de animale pentru Colegiul Medicinii). Toate animalele au fost tratate în conformitate cu Consiliul canadian pentru standardele de îngrijire a animalelor. Șobolani în vârstă de cinci săptămâni au fost plasați pe dieta definită AIN-93G (18) care nu conțin antioxidanți sintetici și cu un conținut de proteine ​​pe bază de cazeină de 18% (Dyets Inc., Bethleham, PA). Grupurile de dietă au fost Grn + (dietă AIN93 plus 200 mg varză de broccoli uscate la aer conținând 5,5 μmol echivalent sulforaphane echivalent cu activitatea de inducere a proteinelor de fază 2) și Grn - (dieta AIN93 singură). Animalele din acest experiment vor fi denumite animale din prima generație. Unora dintre animalele din dieta Grn + li s-a permis să rămână însărcinate, iar la înțărcare descendenții a 3 dintre aceste animale au fost plasați fie în dieta Grn - fie Grn +. Acești descendenți vor fi denumiți animale de a doua generație.

Presiunile sanguine sistolice au fost măsurate bisăptămânal folosind o pletismografie indirectă a manșetei cozii, așa cum sa descris anterior (14).

Izolarea țesuturilor din SHRsp feminin

La vârsta de 6 luni, femeile SHRsp din prima și a doua generație, în timp ce erau sub anestezie cu halotan, au fost perfuzate prin aorta ascendentă cu 0,05 M fosfat heparinizat - soluție salină tamponată și țesuturi, inclusiv aortă, artera carotidă, inimă, creier și rinichi, au fost eliminate. Unele țesuturi aortice din generația parentală au fost utilizate imediat după izolare pentru studii de tensiune izometrică, în timp ce restul de țesuturi au fost înghețate imediat în azot lichid și pregătite pentru măsurători GSH, măsurători ale activităților enzimatice și analize Western blot, după cum sa raportat anterior (14).

Măsurători ale funcției endoteliale

Pentru studii de tensiune izometrică, aortele toracice colectate în urma perfuziei saline tamponate au fost curățate de țesut adipos și tăiate în inele de 2 - 3 - mm. Inelele au fost suspendate sub tensiune de 1,0 g într-o cameră de baie de organe de 10 ml umplută cu soluție salină Krebs aerată cu 95% O2 și 5% CO2, așa cum s-a descris anterior (14, 19). Am adăugat 1 μmol/l indometacină în serul salin Krebs care era compus din 115 mM NaCI, 5,4 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 11 mM D-glucoză și 1,8 mM CaCl2. Fenilefrina (3 × 10 −7 M) a fost utilizată pentru a induce contracția, iar în contracția tonică stabilă, acetilcolina (ACh) sau nitroprusidul de sodiu au fost introduse în soluția de baie. Tensiunea izometrică a fost măsurată la 37 ° C cu traductoare de deplasare a forței FT 03 (Grass Instrument, Quincy, MA). Achiziția și analiza datelor au fost realizate cu un sistem Biopac (Biopac System, Golata, CA).

Măsurători Western blot

Conținutul de proteine ​​a fost determinat utilizând procedura de acid bicinconinic cu ser albumină bovină ca referință (29). Pentru analizele Western blot, proteinele au fost separate pe geluri de poliacrilamidă folosind un sistem de electroforeză mini-verticală (Bio-Rad, Hercules, CA), transblotate pe membrane și membrane de nitroceluloză apoi incubate cu anticorpi primari corespunzători urmată de incubare cu peroxidază de ridiche de cal - conjugată anticorp secundar (Bio-Rad) așa cum s-a făcut înainte (14). Proteinele au fost vizualizate folosind Chemiluminescence Substrate Kit (Amersham, Piscataway, NJ) și cuantificate folosind un analizor computerizat de imagine Scion. Membrana a fost reprobată cu anti-β-actină (Sigma, St. Louis, MO). Cuantificarea a fost relativă la β-actina. Anticorpii monoclonali utilizați au fost antiICAM1 (Sc - 8439: Santa Cruz), iNOS (Transduction Laboratories) și nitrotirozină (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Anticorpii policlonali de iepure (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) au fost folosiți pentru NFκB p65 și IκBα.

Măsurători de apărare antioxidantă

Conținutul GSH și GSSG au fost determinate folosind o metodă HPLC descrisă anterior (14). Activitățile glutation peroxidazei (GPx) și glutation reductazei (GRed) au fost măsurate așa cum s-a descris anterior (20).

Izolarea țesuturilor din SHRsp masculin pentru imunocitochimie

SHRsp masculi de generația I și a 2-a, utilizați pentru studii imunohistochimice, au fost perfuzați cu soluție salină tamponată cu fosfat heparinizat și apoi au continuat cu aceeași soluție conținând 4% paraformaldehidă descrisă anterior (14). Secțiunile înghețate au fost tăiate de pe măduva spinării toracică și imunizate cu ajutorul anticorpului ED-1 (Serotec, Oxford, Marea Britanie) care recunoaște microglia/macrofagele activate, urmate de un sistem de detectare avidin-biotină-peroxidază (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± SE și analizate folosind un Welch cu două cozi t test sau ANOVA coroborat cu testul post hoc Tukey, acolo unde este cazul.

REZULTATE

La fel ca la bărbații din studiul nostru anterior (14), presiunile sanguine sistolice feminine începeau deja să fie crescute peste 120 mm Hg cu vârsta de 6 săptămâni (Fig. 1), cea mai timpurie care putea fi măsurată cu manșeta cozii. Spre deosebire de bărbații din dieta Grn - tensiunea arterială stabilizată la 15 săptămâni, la femele presiunea sanguină s-a stabilizat la vârsta de 9-10 săptămâni la 180 mm Hg la (Fig. 1). Pentru femelele care au luat dieta Grn +, presiunile sanguine au crescut până la 7 săptămâni, după care au rămas stabile la ~ 157 mm Hg pe tot restul perioadei de studiu (Fig. 1). La fel ca la bărbații din studiul nostru anterior, tensiunea arterială mai mică observată cu o dietă Grn + s-a corelat cu o funcție mai bună a celulelor endoteliale, așa cum se observă printr-un răspuns mai bun de relaxare la acetilcolină (Fig. 2A). Tensiunea arterială mai mică s-a corelat și cu un răspuns muscular mai neted la oxidul nitric (Fig. 2B).

abordările

Graficul presiunii sanguine sistolice (medie ± SE) a SHRsp feminin din prima generație plasată fie pe Grn +, fie pe Grn - dietă la vârsta de 5 săptămâni (n= 9). Până la vârsta de 9 săptămâni, femeile din dieta Grn + aveau un nivel semnificativ mai mic (**P - dietă (n= 9 pe grup de dietă).

Grafice ale funcției de relaxare aortică în prima generație feminină Grn - și Grn + (n= 9 pe grup). A) Inelele aortice au fost precontractate cu fenilefrină urmate de administrarea de acetilcolină (ACh) și s-a măsurat scăderea tensiunii. Aortae din Grn + SHRsp au avut semnificativ mai mari (204889P - SHRsp. B) Inelele aortice au fost precontractate cu fenilefrină și tensiunea a fost măsurată în prezența diferitelor concentrații de nitroprusidă de sodiu (SNP), un donator de oxid nitric. SNP a cauzat semnificativ mai mare (*P + SHRsp decât aortele de la Grn - SHRsp.

Ca și în studiul nostru anterior asupra SHRsp masculin, dieta Grn + a condus la o stare redox mai bună (Fig. 3A, 3B) la prima generație feminină, după cum este exemplificat prin creșterea (de la 47-94%) a conținutului de GSH și scăderea (de la 20-45%) a GSSG în țesuturile examinate (artera carotidă, aorta, inima și rinichii). Raporturile GSH: GSSG în grupul Grn - femele de prima generație au variat de la 3,1 la 5,8 în țesuturile examinate, oarecum mai mici decât cele observate anterior la SHRsp masculi pe o dietă Grn (14). Raportul GSH: GSSG în grupul Grn + al femelelor de prima generație a crescut, variind de la 7,7 la 10,7, din nou oarecum mai mic decât cel observat anterior la bărbații la o dietă Grn + (14). În aceleași țesuturi, o dietă Grn + a fost asociată cu activități crescute (de la 25-125%) GPx și activități crescute (de la 55-80%) GRed (Fig. 4A, 4B). Aceștia sunt toți indicatori ai unui stres oxidativ mai redus (5). Astfel, există indicatori clari că o dietă Grn + are ca rezultat un stres oxidativ mai mic și o mai bună capacitate de eliminare a oxidantului la SHRsp feminin la fel ca la bărbați.

Grafice care prezintă GSH (A) și GSSG (B) niveluri în SHRsp de primă generație feminină în grupul Grn + în raport cu nivelurile prezente în grupul Grn (medie ± SE, n= 6/grup). Sub fiecare dintre grafice sunt valorile reale ale GSH și GSSG în nmoli per miligram de proteine ​​± SE. O dietă Grn + a crescut semnificativ GSH (204889P

Grafice care prezintă glutation peroxidaza relativă (GPx) (A) și glutation reductază (GRed) (B) activități în prima generație feminină de diete Grn - și Grn + (n= 6/grup de dietă). Sub fiecare dintre grafice sunt valorile reale în termeni de nmoli NAD (P) H oxidată/min/mg proteină ± SE. Atât pentru GPx, cât și pentru GRed, activitățile sunt semnificativ mai mari (*P + grup dietetic.

Apoi am pus întrebarea dacă o dietă Grn + în timpul sarcinii și înțărcării ar influența presiunea sanguină a descendenților. Atât descendenții bărbați, cât și femelele de la mame care au urmat o dietă Grn + au atins presiuni sanguine sistolice semnificativ mai mici. Figura 5 ilustrează datele obținute de la descendenții feminini. Acești descendenți din dieta Grn măsurată la 11-17 săptămâni au avut presiuni sanguine sistolice identice (~ 155 mm Hg) cu femelele din prima generație ținute la o dietă Grn + de la vârsta de 5 săptămâni. Descendenții din dieta Grn + au avut presiuni sanguine la 11 săptămâni, care au fost semnificativ mai mici (142 mm Hg) decât descendenții din dieta de control. Până la 17 săptămâni, această diferență, deși mai mică (5 mm Hg), era încă foarte semnificativă.

Graficul presiunii sanguine sistolice a descendenților feminini (a doua generație: triunghiuri, medie ± SE, n= 6 per grup de diete) de femele plasate pe o dietă Grn + comparativ cu presiunea sângelui din prima generație (cercuri reprezentând aceleași date ca în FIG. 1). Descendenții au fost așezați fie pe dieta Grn - (triunghiuri deschise), fie pe Grn + (triunghiuri închise), de la înțărcare. Nu există diferențe în ceea ce privește tensiunea arterială măsurată între descendenții plasați pe dieta de control și prima generație plasată pe dieta Grn +. Descendenții din dieta Grn + au avut un nivel semnificativ mai scăzut (¥) P + dietă.

Graficele care descriu cuantificarea datelor de proteine ​​Western blot din prima generație feminină, fie pe dieta Grn - fie pe cea Grn +, precum și descendenții (a doua generație) de femele din dieta Grn +, descendenții fiind plasați fie pe dieta Grn - fie Grn +. Grafic sunt media ± SE a semnalului proteic normalizat la β - actină (n= 3 pe grup). Absența SE vizibil indică faptul că SE sunt prea mici pentru a fi vizualizate. Analizate au fost creierul iNOS (A), rinichi ICAM1 (B), rinichi iNOS (C), proteină nitrosilată majoră

45 kD) în rinichiD) și raportul NFκB p65/IκBα în rinichi (E). Sub fiecare bară se află un western blot reprezentativ. Imediat dedesubt FIG. 6E bare sunt pete Western NFκB reprezentative p65 și sub pete p65 sunt pete IκBα reprezentative. * Semnificativ diferit (P - dietă; ** semnificativ diferit (P - dietă; † semnificativ diferit (P + dietă; †† diferit semnificativ (P + dietă; ‡ semnificativ diferit (P - dietă; ‡ ‡ semnificativ diferit (P - dietă; ¥ semnificativ diferit (P - dietă.

Numărul de microglie/macrofage activate pe secțiune transversală a măduvei spinării toracice SHRsp masculi, determinat de imunocitochimia ED1. Valorile sunt medii ± SE. Prima generație Grn + este semnificativ mai mică (204889P -. Descendenți (a doua generație) Grn - este semnificativ mai mic (††† P + . Descendența Grn + este semnificativ mai mică (¥ P -. Au fost analizate șase secțiuni toracice la fiecare dintre cele 6 animale pe grup.

DISCUŢIE

Cercetările noastre arată, într-un model animal care experimentează un stres oxidativ considerabil la o vârstă relativ mică, că consumul unei diete bogate în inductori de proteine ​​de fază 2 tinde să normalizeze potențialele redox celulare, așa cum este demonstrat de rapoarte GSH: GSSG mai mari. Activitățile crescute ale GPx și GRed în grupul de dietă Grn + sunt congruente cu stres oxidativ redus, deoarece ambele enzime sunt susceptibile la inactivarea oxidativă (21), iar expresia bazală a GPx este dependentă de Nrf2, în timp ce atât expresia bazală, cât și cea indusă de GRed sunt dependente de Nrf2 (10). Descoperirile noastre anterioare că o dietă Grn + a crescut foarte mult Nrf2 localizat nuclear în endoteliul vascular (15) și constatările noastre actuale privind creșterea nivelului de GSH vascular și activitatea crescută GRed susțin ipoteza că dieta Grn + are ca rezultat creșterea expresiei genei proteinelor de fază 2 și capacitate mai mare de a elimina oxidanții decât dieta de control.

Scăderea stresului oxidativ și a inflamației nu a fost limitată la țesuturile renale și vasculare, deoarece iNOS creierului a fost redus semnificativ în grupul cu dieta Grn +, la fel ca și numărul de microglii activate de măduva spinării. Acest lucru este în acord cu constatările noastre anterioare (15). Este foarte posibil ca această stare inflamatorie redusă a SNC să fie secundară unei stări de sănătate vasculară mai bune.

Sunt modificările fiziopatologice observate în SHRsp relevante pentru starea umană? Mulți dintre factorii care contribuie la programarea fetală negativă a sănătății adulților promovează creșterea stresului oxidativ și a inflamației (4). Restricția proteică-calorică este unul dintre factorii care au un impact negativ asupra factorilor determinanți fetali ai adulților sănătoși (24). La om, malnutriția proteică-energie este asociată cu scăderea nivelului de GSH plasmatic (25) și cu inflamația crescută (25, 26). Mai mult, sugarii născuți din mame subnutriți prezintă stres oxidativ atunci când este examinat sângele (27).

Cum ar putea fi mediate astfel de efecte terapeutice demonstrate în acest studiu? Ipoteza predominantă a motivului pentru care restricția proteinei-calorii în timpul dezvoltării fetale duce la efecte adverse la adult este „ipoteza genei economice”, care afirmă că fătul se adaptează la o lume alimentară - rară prin reprogramarea epigenomului și apoi intră într-un aliment ‐Lumă abundentă (4). Epigenomul este modulat, cel puțin parțial, prin metilarea citozinei în citozină - guanozină se repetă în genom (28). Direcțiile noastre viitoare sunt să examinăm modificările epigenomice influențate de stresul oxidativ. Într-adevăr, la șobolan, insuficiența uteroplacentară, care afectează negativ factorii determinanți ai sănătății adulților, are ca rezultat hipometilarea la nivelul genomului în ficatul descendenților (29). Acest lucru sugerează că insuficiența uteroplacentară interferează cu ADN metilazele, posibil prin inactivarea oxidativă a acestor metilaze.

În rezumat, am arătat că normalizarea stării redox a țesuturilor și normalizarea presiunii sanguine la femeile însărcinate SHRsp folosind o abordare dietetică are un impact pozitiv asupra sănătății adulților descendenților.