Milo Careaga

un Departament de Psihiatrie și Științe Comportamentale, Universitatea din California, Davis, SUA

b Institutul MIND, Universitatea din California, Davis, SUA

Sandra L. Taylor

c Departamentul de Științe ale Sănătății Publice, Universitatea din California, Davis, SUA

Carolyn Chang

b Institutul MIND, Universitatea din California, Davis, SUA

Alex Chiang

un Departament de Psihiatrie și Științe Comportamentale, Universitatea din California, Davis, SUA

b Institutul MIND, Universitatea din California, Davis, SUA

Katherine M. Ku

un Departament de Psihiatrie și Științe Comportamentale, Universitatea din California, Davis, SUA

b Institutul MIND, Universitatea din California, Davis, SUA

Robert F. Berman

b Institutul MIND, Universitatea din California, Davis, SUA

d Departamentul de Chirurgie Neurologică, Universitatea din California, Davis, SUA

Judy A. Van de Water

b Institutul MIND, Universitatea din California, Davis, SUA

e Medicină internă, Divizia de reumatologie, Universitatea din California, Davis, SUA

Melissa D. Bauman

un Departament de Psihiatrie și Științe Comportamentale, Universitatea din California, Davis, SUA

b Institutul MIND, Universitatea din California, Davis, SUA

f Centrul Național de Cercetare pentru Primate din California, Universitatea din California, Davis, SUA

Date asociate

Abstract

Infecția maternă în timpul sarcinii poate crește riscul apariției tulburărilor neurodezvoltării. Modelul preclinic al acidului polinozinic-policitidilic (PolyIC) a devenit una dintre cele mai utilizate abordări în cercetarea activării imune materne (MAI). Cu toate acestea, variabilitatea greutății moleculare poate avea impact asupra potențialului de activare imună a PolyIC. Șobolanii nulipari injectați cu PolyIC cu greutate moleculară ridicată prezintă un răspuns pronunțat la citokine și comportament de boală care nu a fost observat la șobolanii injectați PolyIC cu greutate moleculară mică. Deși un pas esențial următor este extinderea acestor studii la animalele însărcinate, rezultatele preliminare sugerează că greutatea moleculară PolyIC este un aspect experimental important.

1. Introducere

2. Metode

Toate procedurile au fost efectuate cu aprobarea de către Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din California, Davis și în conformitate cu liniile directoare furnizate de Institutele Naționale de Sănătate pentru tratamentul științific al animalelor. Datele sunt disponibile la cerere.

2.1. Animale

Șobolani de sex feminin Sprague-Dawley (Harlan Sprague-Dawley, Inc., Indianapolis, IN), în vârstă de 8 săptămâni, au fost întreținuți de Serviciile de Învățare și Cercetare a Animalelor (TRACS), de la Universitatea din California, Davis. Toți șobolanii au fost adăpostiți în perechi într-un vivariu controlat de temperatură și umiditate și menținuți la temperatura camerei ambiante de 22,9 ° C și 53% umiditate pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (lumină aprinsă la 06:00). Carcasa standard pentru cușcă de casă consta din sisteme de carcase din polipropilenă cu cușcă cu ventilație individuală (IVC) de la Produse de laborator care măsoară 30,5 cm × 35,6 cm × 20,3 cm, cu capace superioare de sârmă superioară, așternuturi din sticlă și cuiburi. Animalele santinelă care sunt expuse maxim la toate celelalte animale din vivariu fac parte dintr-un program cuprinzător de monitorizare a sănătății utilizat pentru a detecta infecțiile care pot fi prezente în colonie. Hrana și apa au fost furnizate ad libitum pe tot parcursul studiului. Șobolanilor li s-a permis să se obișnuiască la vivariu după sosirea din laboratoarele Harlan timp de cel puțin două săptămâni înainte de efectuarea oricărei proceduri.

2.2. MOLUȘTE COMESTIBILE

CLAMS (Comprehensive Lab Animal Monitoring System) este un sistem de cuști metabolice care permite măsurarea simultană a numeroșilor parametri metabolici, inclusiv consumul de oxigen, producția de dioxid de carbon, consumul de alimente, nivelurile de activitate locomotorie etc. Camera care adăpostește CLAMS a fost menținută la 24 ° C și 55% umiditate. Cuștile sunt închise într-un mediu controlat de lumină și temperatură, permițând utilizatorului să colecteze date la temperaturi ambiante variate. Mediul din CLAMS a fost menținut la 24 ° C pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (lumina aprinsă la 06:00). Hrana și apa au fost furnizate ad libitum. Consumul de apă, alimente, O2 și producția și activitatea de CO2 au fost monitorizate timp de 24 de ore înainte și timp de 24 de ore după injectarea Poly IC sau a vehiculului. Datele au fost înregistrate de la animale imediat după ce au fost introduse înapoi în CLAMS după injecții.

2.3. Activare imună

2.4. Recoltarea sângelui

Sângele a fost colectat de la șobolani în trei puncte de timp; 3, 4,5 și 6 ore după injectare. Șobolanii au fost îndepărtați individual din CLAMS și reținuți fără anestezie în timp ce 100 μL de sânge au fost colectați din vena cozii folosind un ac de 26 g. Temperatura a fost luată rectal și înregistrată imediat înainte de recoltarea sângelui. Recoltările de sânge au fost de obicei finalizate în decurs de 5 minute. Sângele a fost lăsat să se coaguleze timp de cel puțin o oră și apoi centrifugat la l000g timp de 10 min. Serul a fost colectat și depozitat la -80 ° C până la analizarea nivelurilor de citokine. Probele de timp de 4,5 ore au fost arhivate pentru comparații viitoare cu probe colectate de la șobolani însărcinați în urma injecțiilor PolyIC, astfel doar punctele de timp de 3 ore și 6 ore sunt incluse în prezentul studiu.

2.5. Analiza citokinelor

Nivelurile de citokine serice IL-1β, IL1-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN -γ și TNFa au fost determinate folosind imunoanalize cu șirag de multiplexare a șobolanilor (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Probele au fost rulate în duplicat conform specificațiilor producătorului. Toate probele au fost diluate 1: 4 în diluantul probei furnizat de producător. 50 μL de ser diluat au fost incubate cu margele cuplate cu anticorpi. După o serie de spălări, s-a adăugat o detectare a anticorpului biotinilat la margele, iar amestecul de reacție a fost detectat prin adăugarea de streptavidină-ficoeritrină. Seturile de margele au fost analizate folosind un sistem de suspensie bazat pe flux Luminex ™ 100 (Bio-Plex 200; Bio-Rad Laboratories). Concentrațiile de citokine eșantioane necunoscute au fost calculate de software-ul Bio-Plex Manager utilizând o curbă standard derivată din concentrațiile de citokine de referință cunoscute furnizate de producător. A fost utilizat un model cu cinci parametri pentru a calcula concentrațiile finale. Concentrațiile obținute sub limita de sensibilitate de detectare (LOD) au fost calculate ca LOD/2 pentru comparații statistice. Alicote supernatante nu au avut niciun ciclu anterior de îngheț/dezgheț. Doar 2% din eșantioane au depășit alocația de variație CV de 15% și au fost ulterior re-analizate.

2.6. analize statistice

3. Rezultate

3.1. Diferențe de citokine între grupuri

variabilitatea

Răspunsul IL-6 după injecția PolyIC. Doar animalele care au primit HMW-PolyIC demonstrează niveluri crescute de IL-6 comparativ cu martorii salini la 3 ore și 6 ore după injectare. * P Tabelul 4. Doar animalele care au primit HMW-PolyIC au demonstrat pierderea în greutate, modificări ale consumului de O 2/producția de CO 2 și comportamente reduse de hrănire și băut comparativ cu animalele cu soluție salină injectată (Fig. 3). Animalele care au primit LMW-PolyIC nu au diferit de controale. Măsurătorile temperaturii și activității corpului nu au diferit între cele trei grupuri de tratament.

Șobolanii care au primit LMW-PolyIC nu au prezentat diferențe semnificative în comparație cu șobolanii care au primit soluție salină. Cu toate acestea, șobolanii care au primit HMW-PolyIC au prezentat diferențe semnificative în (A) pierderea în greutate, (B) producția de CO2, (C) consumul de O2, (D) Aportul de alimente și (D) Aportul de apă în comparație cu șobolanii care au primit soluție salină. * P ser fiziologic (p Tabelul 1). Au fost găsite interacțiuni semnificative între grupul de tratament și timp pentru IL-6, TNFα, IL-1β și IFN-γ. Atât pentru IL-6 (Fig. 1), cât și pentru IFN-γ (Fig. 2), animalele injectate HMW-PolyIC au demonstrat niveluri semnificativ mai mari comparativ cu martorii salini la ambele 3 h și 6 h după injectare. Deși nivelurile IL-6 și IFN-γ pentru animalele injectate LMW-PolyIC au fost, de asemenea, mai mari decât martorii, aceste diferențe nu au fost semnificative în niciun moment. TNFα și IL-1β (Fig. 2) au diferit semnificativ între animalele injectate HMW-PolyIC și martorii la ambele puncte de timp, deși animalele injectate LMW-PolyIC au diferit doar de controale la 3 ore, dar nu la 6 ore după injectare. Pentru restul de citokine care nu au demonstrat o interacțiune semnificativă între grupul de tratament și timp, nivelurile medii au diferit semnificativ între animalele injectate HMW-PolyIC și martori, dar nu între animalele injectate LMW-PolyIC și martorii pentru toate citokinele, cu excepția GM-CSF (Tabelele 2, 3; 3; Material suplimentar).

Rezultatele noastre indică faptul că PolyIC cu greutăți moleculare variate poate induce în mod semnificativ răspunsuri diferite ale citokinelor și comportamente de boală in vivo, care pot contribui la probleme de reproductibilitate continuă ale modelului MIA (Begley și Ioannidis, 2015). Aceste rezultate sunt în concordanță cu studiile anterioare de stimulare celulară (Mian și colab., 2013; Zhou și colab., 2013) și oferă o perspectivă asupra posibilelor mecanisme care stau la baza rapoartelor de variabilitate în proprietățile de activare a sistemului imunitar PolyIC (Harvey și Boksa, 2012). Având în vedere că sarcina modifică răspunsurile imune ale mamei, un pas esențial următor este caracterizarea răspunsurilor citokinelor HMW-PolyIC și LMW-PolyIC și a comportamentelor de boală la animalele gravide. În timp ce experimentele pe animale gravide sunt în desfășurare, aici vă prezentăm rezultatele preliminare care au implicații pentru câmpul în creștere al cercetării modelului MAI și pot oferi informații metodologice necesare pentru a îmbunătăți rigurozitatea și reproductibilitatea acestui valoros model translațional.

Material suplimentar

Suplimentar

Mulțumiri

Această cercetare a fost susținută de premii pilot acordate de M.D.B de la MIND Institute Intellectual and Developmental Disability Research Center (U54> HD079125) și de la UC Davis Behavioral Health Center of Excellence. M.C. a fost sustinut de UC Davis Autism Research Program de formare (T32MH073124) si UC Davis Behavioral Health Centrul de excelenta. Autorii vor să mulțumească lui Peter Takeuchi, Josef Rivera și Laboratorului de fenotipare a comportamentului șobolanilor UC Davis pentru ajutorul lor extins cu CLAMS și îngrijirea generală a animalelor. De asemenea, dorim să mulțumim Centrului de analiză biologică al Centrului de cercetare a dizabilităților intelectuale și de dezvoltare UC Davis (IDDRC), în special Lori Haapanen, pentru asistență în cuantificarea citokinelor, precum și Biostatisticii, Bioinformaticii și Cercetării de bază pentru asistență analize statistice.

Note de subsol

Autorii au declarat că nu există interese concurente.