O Boruga

* Departamentul de Oftalmologie, Universitatea de Medicină și Farmacie Victor Babeș, Timișoara, România

C Jianu

** Departamentul de Știința Alimentelor, Facultatea de Tehnologia Prelucrării Alimentelor, Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară din Banat, Timișoara, România

C Mischa

** Departamentul de Știința Alimentelor, Facultatea de Tehnologia Prelucrării Alimentelor, Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară din Banat, Timișoara, România

I Goleț

*** Departamentul de Management, Facultatea de Economie și Administrarea Afacerilor, Universitatea de Vest din Timișoara, Timișoara, România

AT Gruia

**** Center for Transplant Immunology, Spitalul Județean Timișoara, Timișoara, România

FG Horhat

***** Departamentul de Microbiologie, Universitatea de Medicină și Farmacie Victor Babeș, Timișoara, România

Abstract

Studiul a fost conceput pentru a determina compoziția chimică și proprietățile antimicrobiene ale uleiului esențial de Thymus vulgaris cultivat în România. Uleiul esențial a fost izolat cu un randament de 1,25% prin distilare cu abur din partea aeriană a plantei și ulterior analizat prin GC-MS. Componentele majore au fost p-cimen (8,41%), γ-terpinen (30,90%) și timol (47,59%). Activitatea sa antimicrobiană a fost evaluată pe 7 bacterii și ciuperci obișnuite legate de alimente, utilizând metoda de difuzare a discului. Rezultatele demonstrează că uleiul esențial de Thymus vulgaris testat posedă proprietăți antimicrobiene puternice și poate reprezenta în viitor o nouă sursă de antiseptice naturale cu aplicații în industria farmaceutică și alimentară.

Introducere

Genul Thymus, membru al familiei Lamiaceae, conține aproximativ 400 de specii de plante erbacee perene aromatice, veșnic verzi sau semi-veșnic verzi, cu multe subspecii, soiuri, subvarietăți și forme [1]. În România, genul Thymus conține o specie cultivată ca plantă aromatică (Thymus vulgaris) și alte 18 specii sălbatice [2]. T. vulgaris (cimbru), cunoscut local ca „cimbru”, este utilizat pe scară largă în medicina populară românească pentru proprietățile sale expectorante, antitusive, antibroncolitice, antispastice, antihelmintice, carminative și diuretice.

Diverse studii au avut ca scop investigarea compoziției chimice și a proprietăților biologice ale uleiului esențial de T. vulgaris (EO). Conform Farmacopeei Europene 5.0 (Ph. Eur. 5.0) [3], conținutul minim de EO în T. vulgaris este de 12 mL/kg, dar compoziția chimică prezintă variații, șase chimiotipuri fiind raportate în principal, și anume geraniol, linalool, gamma-terpineol, carvacrol, timol și trans-thuan-4-ol terpinen-4-ol [4,5]. Atât randamentul de izolare, cât și compoziția chimică a EO sunt dependente de o serie de factori, cum ar fi mediul, regiunea de creștere și practicile de cultivare [6]. Pe lângă proprietățile aromatizante determinate de ingredientele active constitutive, cimbrul EO prezintă o activitate antimicrobiană semnificativă [4,7-9] precum și puternice proprietăți antioxidante [2,8].

Scopul acestui studiu este de a determina compoziția chimică împreună cu proprietățile antimicrobiene ale EO de T. vulgaris cultivate în România, pentru a identifica noi surse de antiseptice naturale cu aplicații în industria farmaceutică și alimentară.

Materiale și metode

Materii prime. Cimbrul a fost recoltat în timpul sezonului de înflorire (iulie 2012) din zona din jurul comunei Broșteni - județul Mehedinți, România. Materialul vegetal a fost uscat în zone bine ventilate, protejat de lumina directă a soarelui și apoi depozitat în pungi de hârtie cu două straturi la temperaturi de 3-5 ° C până la prelucrare. Un specimen de voucher (V.FPT-451) a fost depus în Herbarul Facultății de Farmacie, Universitatea de Medicină și Farmacie „Victor Babeș”, Timișoara, România.

Izolarea uleiurilor esențiale. EO a fost obținut prin hidrodistilație, conform Ph. Euro. 5.0 [3], prin utilizarea unui aparat Clevenger modificat (cu zona de colectare EO răcită pentru a preveni apariția artefactelor). EO a fost uscat pe sulfat de sodiu anhidru (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) și depozitat într-o sticlă de sticlă maro închisă bine etanșată la 0-4 ° C pentru testare.

Cromatografie de gaze-spectrometrie de masă. Probele au fost analizate prin cromatografie gazoasă folosind un instrument HP6890 cuplat cu un spectrometru de masă HP 5973. Cromatograful de gaze este echipat cu un injector split-splitless și un factor Factor FourTM VF-35ms 5% fenil-metilpolisiloxan, 30 m, 0,25 mm, 0,25 μm grosime a filmului coloană capilară. Condițiile de cromatografie cu gaze includ un interval de temperatură de la 50 la 250 ° C la 40 ° C/min, cu o întârziere a solventului de 5 min. Injectorul a fost menținut la o temperatură de 250 ° C. Gazul inert a fost heliu la un debit de 1,0 ml/min, iar volumul injectat în modul fără split a fost de 1 μL. Condițiile MS au fost următoarele: energie de ionizare, 70 eV; temperatura cvadrupolului, 100 ° C; viteza de scanare, 1.6 scanare/s; interval de greutate, 40-500 amu.

S-a calculat compoziția procentuală a compușilor volatili. Analiza calitativă s-a bazat pe suprafața procentuală a fiecărui vârf al compușilor probei. Spectrul de masă al fiecărui compus a fost comparat cu spectrul de masă din biblioteca de spectre NIST 98 (software-ul SUA Institutul Național de Știință și Tehnologie).

Determinarea activității antimicrobiene. Cimbrul EO a fost testat pe 7 bacterii și ciuperci frecvente legate de alimente: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae, ATtero 13882 faecalis 29212) și Candida albicans (ATCC 10231), utilizând metoda de difuzare a discului, așa cum a fost descris anterior [10]. Pe scurt, o suspensie a microorganismului testat (10 ^ 6 celule/mL-1) a fost răspândită pe plăcile mediilor solide (agar Mueller-Hinton pentru bacterii și agar cloramfenicol Sabouraud pentru ciuperci). Discurile de hârtie (hârtie de filtru Whatman nr. 1 - diametru 6 mm) au fost impregnate cu 5, 10, 15 și 20 uL EO și plasate pe agarul inoculat. Plăcile inoculate cu tulpini bacteriene au fost incubate timp de 24 de ore la 37 ° C și respectiv 48 de ore la 30 ° C pentru ciuperci. Ca martori pozitivi, ciprofloxacina (30 µg/disc) și cefalexina (10 µg/disc) au fost utilizate pentru tulpini bacteriene și fluconazol (10 µg/disc) pentru ciuperci. După incubare, diametrul zonei de inhibiție a fost măsurat în milimetri. Fiecare test a fost efectuat în triplicat pe cel puțin trei experimente separate.

analize statistice. Analiza statistică a fost efectuată folosind SPSS Versiunea 21 (IBM Corp., NY). Zona medie de inhibare pentru fiecare grup de nouă observații a fost comparată cu valoarea diametrului discului (6 mm) folosind testul t. Procedura GLM a fost utilizată pentru a efectua o analiză bidiară a varianței (ANOVA) pe zonele de inhibare. Tipul de microorganism și cantitatea de ulei esențial au fost utilizate ca factori în modelul factorial complet. Testele post-hoc pentru fiecare cantitate de ulei esențial au fost efectuate folosind metoda HSD a lui Tukey, pentru a compara efectul asupra diferitelor tipuri de microorganisme.

Rezultate si discutii

Randamentul de izolare a fost de 1,25% (v/g), pe baza materialului vegetal uscat și a confirmat că planta analizată îndeplinește cerințele de calitate farmaceutică pentru cimbru ca sursă de EO [3]. Compoziția chimică determinată de GC/MS este prezentată în tabelul 1 . Au fost identificate 15 componente, reprezentând 99,91% din totalul constituenților detectați. Componentele majore au fost p-cimen (8,41%), γ-terpinen (30,90%) și timol (47,59%), ceea ce sugerează că EO analizat aparține chimotipului timolului în acord cu cele raportate anterior în România [2]. Celelalte componente au fost prezente într-o cantitate totală mai mică de 13,01%. Compoziția chimică a EO analizată de noi este foarte diferită de cea raportată anterior în Maroc și Spania pentru aceeași specie de cimbru [11,12]. Studii similare în Polonia, Iran, Spania și, respectiv, Italia, au raportat ca fiind compuși majori în T. vulgaris EO p-cimen, γ-terpinen și timol [4,13-15]. Aceste diferențe pot fi atribuite în mare măsură diferitelor chimiotipuri menționate mai sus [4,5,13].

tabelul 1

Compoziția chimică a cimbrului EO

Nr. RT (min) Suprafață% din total Componente *8.41 para-Cymene30.90gamma-Terpinen47,59 TimolTotal 99,91%
15.391,06alfa-Tujene
25,631,07alfa-pinen
36,890,37beta-Pinen
46,971,53beta-mircen
57.530,33alfa-felandrenă
67,773,76Carene
78.040,29D-Limonene
88.260,21beta-Phellandrene
98.46
108,96
119.480,47Terpineol
1212,550,46Terpinen-4-ol
1316.17
1417.322,68Caryophyllene
1519.030,78Ciclohexen, 1-metil-4- (5-metil-1-metilen-4-hexenil)
* Constituenții prezentați în ordinea eluării din coloana VF 35 MS.

chimică

Activitatea antimicrobiană a uleiului de cimbru, în cantități diferite, exprimată ca zonă medie de inhibare pentru fiecare dintre cele nouă măsurători repetate

masa 2

Efectele uleiului de cimbru împotriva bacteriilor exprimate prin dimensiunile medii ale zonelor inhibitoare

Testarea microorganismului Cantitatea de ulei esențial [μL] 5101520
Staphylococcus aureus ATCC 2592323,93 ± 0,3329,2 ± 0,629,9 ± 0,3531,4 ± 0,47
Salmonella typhimurium ATCC 1402814,49 ± 0,3419,71 ± 0,3930,68 ± 0,3334,94 ± 0,22
Pseudomonas aeruginosa ATCC2785311,82 ± 0,2713,34 ± 0,3314 ± 0,2214,13 ± 0,19
E. coli ATCC 2592214,63 ± 0,3619,82 ± 0,4130,67 ± 0,3134,99 ± 0,19
Klebsiella pneumoniae ATCC 1388230,21 ± 0,1231,02 ± 0,3132,79 ± 0,2433,93 ± 0,14
Enterococcus faecalis ATCC 292128,99 ± 0,1515,06 ± 0,1515,99 ± 0,1824,06 ± 0,15
Candida albicans ATCC 1023115,14 ± 0,3819,43 ± 0,5525,74 ± 0,2430,2 ± 0,17

Inhibarea creșterii E. coli, K. pneumoniae, S. aureus, P. aeruginosa și E. faecalis a fost raportată anterior [4,7,9] împreună cu eficacitatea împotriva C. albicans [9,16,17] și S. typhimurium [4,9], respectiv. În contrast, unele studii raportează ineficiența EO de cimbru împotriva E. coli [16,17], S. aureus [16] și K. pneumoniae [16].

Inhibițiile sunt exprimate în mm și includ diametrul discului de hârtie (6 mm). Distribuțiile datelor au fost exprimate ca valori medii și abateri standard (SD) (n = 9). Ciprofloxacină și cefalexină (pentru tulpini bacteriene) și, respectiv, fluconazol (pentru ciuperci) au fost utilizate ca martori pozitivi.

Activitatea antimicrobiană a EO depinde de constituenții lor chimici. Aparent, activitatea antimicrobiană a EO analizat este legată de prezența compușilor fenolici (timol) și hidrocarburi terpenice (γ-terpinen), respectiv [4,7,18]. p-Cymene, al treilea element major în funcție de procent, nu prezintă eficacitate antibacteriană atunci când este utilizat singur [7], efectele sinergice fiind totuși atribuite acestuia în raport cu timolul și respectiv γ-terpinena, [19,20], care ar putea reprezenta o altă cauză a activității antimicrobiene înregistrate. Pe de altă parte, o serie de studii au arătat că EOS prezintă o activitate antimicrobiană mai puternică decât cea a constituenților lor principali sau, respectiv, a amestecurilor lor [21,22], care sugerează efecte sinergice ale componentelor minore, dar și importanța tuturor componentelor în raport cu activitatea biologică a OE.

Concluzii

Rezultatele demonstrează eficiența EO de cimbru împotriva bacteriilor și ciupercilor legate de alimente testate. Sinergismul, antagonismul și respectiv efectele aditive ale componentelor EO necesită cercetări suplimentare pentru a elucida mecanismele care stau la baza activității lor biologice, în scopul accesării de noi antiseptice naturale aplicabile în industria farmaceutică și alimentară.