Roluri Conceptualizare, achiziție de fonduri, supraveghere, scriere - revizuire și editare

lung

Școala de afiliere a științelor biomedicale, Centrul SAAD pentru farmacie și diabet, Universitatea Ulster, Coleraine, Co. Londonderry, Irlanda de Nord, Regatul Unit

Investigarea rolurilor, scrierea - schiță originală

Adresa actuală: Colegiul de Științe ale Vieții și Naturii, Universitatea din Derby, Kedleston Road, Derby, Regatul Unit

Școala de afiliere a științelor biomedicale, Centrul SAAD pentru farmacie și diabet, Universitatea Ulster, Coleraine, Co. Londonderry, Irlanda de Nord, Regatul Unit

Roluri Curarea datelor, Analiza formală, Investigație, Metodologie, Scriere - schiță originală

Școala de afiliere a științelor biomedicale, Centrul SAAD pentru farmacie și diabet, Universitatea Ulster, Coleraine, Co. Londonderry, Irlanda de Nord, Regatul Unit

Roluri Administrare proiect, Supraveghere, Scriere - revizuire și editare

Școala de afiliere a științelor biomedicale, Centrul SAAD pentru farmacie și diabet, Universitatea Ulster, Coleraine, Co. Londonderry, Irlanda de Nord, Regatul Unit

  • Finbarr P. M. O’Harte,
  • Vadivel Parthsarathy,
  • Christopher Hogg,
  • Peter R. Flatt

Cifre

Abstract

Citare: O’Harte FPM, Parthsarathy V, Hogg C, Flatt PR (2018) Tratamentul pe termen lung cu analogi acilați de apelin-13 amidă ameliorează diabetul și îmbunătățește profilul lipidic al șoarecilor hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi. PLOS ONE 13 (8): e0202350. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0202350

Editor: Christian Holscher, Universitatea din Lancaster, REGATUL UNIT

Primit: 19 martie 2018; Admis: 1 august 2018; Publicat: 29 august 2018

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante sunt prezente în lucrare.

Finanțarea: Departamentul pentru Economie, Irlanda de Nord (https://www.nidirect.gov.uk/articles/department-economy-studentships, anterior DEL-NI) a acordat o diplomă de doctorat CH și FOH pentru a efectua această lucrare. Finanțarea Invest-NI Proof of Concept (https://www.investni.com/support-for-business/proof-of-concept.html, PoC518) a fost asigurată de FOH și PRF. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Nu s-a primit nicio finanțare externă suplimentară pentru acest studiu.

Interese concurente: FOH, PRF și Universitatea Ulster dețin brevete pentru exploatarea peptidelor pentru tratamentul obezității-diabet. VP și CH declară că nu au conflicte de interese. În ceea ce privește interesele concurente, putem declara, de asemenea, că cererea de brevet relevantă este în curs de procesare din 2015 și nu este încă acordată (în așteptare): (PCT/EP2015/059288) intitulată „Apelin Analogues”. FOH și PRF sunt inventatorii acestui brevet, iar brevetul a fost inițial depus de Universitatea din Ulster în 2015 și este deținut de Universitatea din Ulster. Acest lucru nu modifică aderarea noastră la politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale.

Abrevieri: APJ, receptor portocaliu; ASC, zonă integrată sub curbă; BMC, conținut de minerale osoase; DEXA, absorptiometrie cu raze X cu energie duală; GLP-1, peptidă-1 asemănătoare glucagonului; pGlu, piroglutamil; T2DM, diabet zaharat tip 2

1. Introducere

Diabetul zaharat de tip 2 (T2DM) se caracterizează prin reglarea defectuoasă a metabolismului glucidic, lipidic și proteic [1]. Caracteristica biochimică a T2DM este hiperglicemia cronică rezultată din defecte ale secreției și acțiunii insulinei [2,3]. Peste 425 de milioane de oameni din întreaga lume sunt afectați de boală, care va crește la 628 de milioane până în 2045 [4]. Această creștere se datorează speranței de viață îmbunătățite, obezității și creșterii populației grupurilor etnice cu risc mai mare de boală [5]. De exemplu, în Marea Britanie există o predispoziție crescută a bolii la unele populații etnice (de exemplu, sud-asiatici, indieni și pakistanezi) și acest lucru s-ar putea datora deficiențelor nutriționale dietetice și nivelurilor reduse de activitate fizică obișnuită [6,7]. Hiperglicemia necontrolată duce la complicații macrovasculare și microvasculare, cum ar fi bolile cardiovasculare [8] retinopatie, neuropatie și nefropatie [9,10,11]. Schimbările persistente ale stilului de viață și intervenția farmacologică sunt esențiale pentru a obține un control metabolic bun și pentru a reduce riscul de complicații induse de hiperglicemie.

Obezitatea viscerală este cel mai frecvent factor de risc asociat cu T2DM și alte boli cronice, inclusiv ateroscleroza, hipertensiunea arterială [12]. Dieta occidentală modernă, combinată cu un stil de viață sedentar, a dus la o pandemie de obezitate, care este acum o problemă severă de sănătate publică [13,14]. Agenții farmaceutici cu acțiuni duale pentru a corecta hiperglicemia și a promova greutatea sunt puțini și există doar între agoniști ai receptorilor GLP-1 care se dovedesc eficienți [15,16]. Chiar și atunci, efectele secundare, cum ar fi greața, pancreatita și posibilul risc de cancer, le limitează utilitatea [17,18,19]. Astfel, există o nevoie semnificativă pentru dezvoltarea de noi agenți farmaceutici cu mai multe fațete, care induc pierderea în greutate și scad atât hiperglicemia, cât și complicațiile asociate, fără a provoca efecte adverse.

Apelin este o peptidă adipokină și circulantă produsă și secretată de adipocite [20]. Mai multe peptide bioactive ale apelinelor, inclusiv apelin-12, -13, -16, -17, -19 și -36 sunt produse ale genei APLN, localizate pe cromozomul 11q12 [21], cu apelin-13 și apelin-36 fiind cele mai abundente și forme biologic active [22]. Receptorul uman de apelină, APJ, este prezent omniprezent în țesuturi [21,23], iar sistemul apelinergic sa dovedit a fi implicat în multiple procese metabolice, inclusiv controlul homeostaziei glucozei [24,25,26].

Degradarea rapidă și perioada de înjumătățire scurtă a izoformelor apelinelor native (4-7 min) împiedică grav exploatarea farmacologică a peptidelor apelinice [27]. Pentru a depăși această problemă, am dezvoltat analogi derivați de acizi grași rezistenți la enzime ale apelin-13 și anume (Lys 8 GluPAL) apelin-13 amidă și pGlu (Lys 8 GluPAL) apelin-13 amidă [28]. În special, acești analogi au același fragment de acid gras conjugat cu Lys 8 utilizând același linker chimic ca și liraglutida mimetică GLP-1 [29]. Acești analogi stabili de apelină au stimulat secreția de insulină din celulele beta pancreatice clonale, cultura primară a celulelor izolate ale insulelor de șoarece fiind cea mai puternică dintr-o serie de analogi studiați [30]. În studiul de față, efectele metabolice și de reducere a greutății administrării cronice o dată pe zi a amidei apelin-13 (Lys 8 GluPAL) și a apelinei-13 amide pGlu (Lys 8 GluPAL) au fost comparate direct cu liraglutida mimetică GLP-1 utilizând un -sobezitate alimentată cu grăsime obezitate-diabet (DIO).

2. Materiale și metode

2.1. Peptide

Toți analogii apelinului utilizați în studiu au fost personalizați de EZ Biolabs (Carmel, IN, SUA) cu puritate> 95%. Puritatea peptidelor a fost verificată prin RP-HPLC și identitatea structurală a fost confirmată prin spectrometrie de masă cu ionizare electrospray așa cum s-a descris anterior [28]. Pe scurt, modificările peptidei apelin-13 native au fost efectuate pentru a conferi rezistență enzimatică pentru a prelungi activitatea biologică. Mai mult, un distanțier gamma-glutamil cu adjuvant de palmitat (GluPAL) a fost adăugat la lanțul lateral al apelin Lys 8 pentru a promova legarea la proteinele plasmatice și a reduce clearance-ul renal, extinzând astfel bioactivitatea in vivo. Se știe că aceste peptide se leagă și activează receptorul APJ, iar timpul de înjumătățire in vitro a fost> 24 h [28].

2.2. Animale experimentale

Șoarecii masculi elvețieni NIH (Harlan UK Ltd., Blackthorne, Marea Britanie) au fost adăpostiți individual într-o cameră cu aer condiționat (22 ± 2 ° C) cu umiditate relativă de 51 ± 5% și un ciclu de lumină: întuneric de 12 ore (08:00 –20: 00 h). Apa potabilă era disponibilă gratuit. Animalele au fost menținute cu o dietă bogată în grăsimi (45% grăsimi, 20% proteine, 35% carbohidrați; procentul din energia totală 26,15 kJ/g; Dietex International Ltd., Witham, Marea Britanie) de la vârsta de 8 săptămâni pentru un total de 150 de zile pentru a evoca obezitatea-diabetul (DIO) indusă de dietă. Un alt grup de șoareci a fost menținut pe o dietă standard de rozătoare (10% grăsimi, 30% proteine, 60% carbohidrați; procent din energia totală 12,99 kJ/g, Trouw Nutrition, Cheshire, Marea Britanie) și utilizat ca model de controale normale. Dietele bogate în grăsimi similare, care conțin un procent mare de energie din grăsimi, sunt utilizate în mod obișnuit în cercetarea obezității-diabetului [31-33].

2.3. Tratamentul cronic și efectele metabolice

2.5. Analiza terminalului

La sfârșitul perioadei experimentale (ziua 40), țesuturile pancreatice au fost excizate pentru analiza conținutului de insulină [36,37]. Sângele a fost prelevat de la șoareci la post pentru măsurarea profilelor lipidice, inclusiv nivelurile HDL-colesterolului, LDL-colesterolului și trigliceridelor, de către un analizor clinic ILab 650 (Instrumentation Laboratory, Warrington, Marea Britanie). Activitatea amilazei (trusa de testare a amilazei, Abcam, Marea Britanie) și concentrațiile totale circulante de GLP-1 (ELISA, Millipore, Marea Britanie) au fost măsurate așa cum este descris în protocolul producătorului [38].

2.6 Standard etic

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu Legea din 1986 privind animalele din Regatul Unit (proceduri științifice) din 1986 și Directiva UE 2010/63EU pentru experimentele pe animale și aprobate de Comitetul de revizuire a eticii animalelor din Universitatea Ulster. Au fost luate toate măsurile necesare pentru a preveni orice posibilă suferință a animalelor.

2.7. analize statistice

Toate datele au fost analizate cu Prism (v.5.0, GraphPad Software Inc. CA, SUA) și exprimate ca medie ± S.E.M. Greutatea corporală, glucoza, insulina și toate datele GTT au fost analizate folosind o analiză bidiară a varianței (ANOVA) urmată de testul post-hoc student-Newman-Keuls. Aportul cumulativ de alimente a fost analizat folosind testul t Student. Zona de sub curbă (ASC) a fost calculată utilizând regula trapezoidală cu corecție de bază. Toate celelalte date, inclusiv ASC, au fost analizate folosind ANOVA unidirecțional. p Fig. 1.

Efectul cronic al i.p. administrarea de liraglutidă, (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă sau pGlu (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă (fiecare la 25 nmol/kg greutate corporală) timp de 28 de zile în funcție de greutatea corporală (A),% schimbare în greutate (B) aportul cumulativ de energie (C), glucoza din sânge fără post (D) și insulina plasmatică (E). Perioada de tratament reprezentată de bara orizontală neagră. Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 8) unde * p ▽▽ p ▽▽▽ p 8 GluPAL) apelin-13 amidă a fost cea mai eficientă, deoarece șoarecii tratați nu au prezentat nicio diferență semnificativă în excursia globală a glucozei în comparație cu șoarecii slabi de control (Fig. 2B). Tratamentele peptidice au crescut, de asemenea, în mod semnificativ răspunsul global la insulină plasmatică după grupurile de apelină-13 amperină intraperitoneală (P 8 GluPAL), respectiv pGlu (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă sau respectiv grupuri liraglutidice. Sensibilitatea la insulină în toate cele trei grupuri de tratament a șoarecilor a fost îmbunătățită în comparație cu martorii cu hrană bogată în grăsimi (P Fig. 2.

Efectul i.p. administrarea de liraglutidă, (Lys 8 GluPAL) apelin-13 amidă sau pGlu (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă (fiecare la 25 nmol/kg) pe glicemie și răspunsuri de insulină plasmatică la un răspuns intraperitoneal (AD) sau oral ( EH) provocarea glucozei în 18 ore șoareci hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi după 18 ore de post. După 28 de zile, glicemia (A și E) și concentrațiile plasmatice de insulină (C și G) au fost măsurate înainte și după administrarea de glucoză (18 mmol/kg greutate corporală). De asemenea, sunt prezentate răspunsurile la glucoză din sânge și insulină plasmatică integrată (zona de sub curbă; ASC, 0-105 min). Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 8) unde * p ▽ p ▽▽ p ▽▽▽ p Fig. 3.

Efectul i.p. administrarea de liraglutidă, (Lys 8 GluPAL) apelin-13 amidă sau pGlu (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă (fiecare la 25 nmol/kg) pe glicemie (A) și insulină plasmatică (B) răspunsuri la 15 min hrănirea A, B) și sensibilitatea la insulină (C) la șoarecii hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi. Testele au fost efectuate după 28 de zile. Pentru testele de masă, șoarecii au fost posti timp de 18 ore anterior și li s-a oferit acces gratuit la dieta normală timp de 15 minute. Perioada de hrănire este reprezentată de bara orizontală neagră. Sunt incluse, de asemenea, valorile glicemiei și ale insulinei plasmatice (ASC). Pentru testele de sensibilitate la insulină, insulina (25 U/kg greutate corporală) a fost administrată prin i.p. injectare în stare alimentată. Sunt prezentate valorile% glicemiei și AAC (C) pentru 0-60 minute după injectare. Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 8) unde * p ▽ p ▽▽ p ▽▽▽ p 8 GluPAL) apelină-13 amidă (P 8 GluPAL) apelină-13 amidă (P 8 GluPAL) apelină-13 amidă reducând colesterolul total (P 8 GluPAL) apelină-13 amidă (P 8 GluPAL) apelină-13 amidă 4.

Efectul i.p. administrare de liraglutidă, (Lys 8 GluPAL) apelin-13 amidă sau pGlu (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă (fiecare la 25 nmol/kg greutate corporală). După 40 de zile de HbA1c (A), colesterolul total plasmatic (B), trigliceridele (C), colesterolul HDL (D) și colesterolul LDL (E), după 40 de zile de tratament au fost măsurate la șoareci hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi. Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 8) unde * p ▽ p ▽▽ p 8 GluPAL) apelină-13 amidă (P Fig. 5.

Efectul i.p. administrare de liraglutidă, (Lys 8 GluPAL) apelin-13 amidă sau pGlu (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă (fiecare la 25 nmol/kg greutate corporală) asupra activității α-amilazei (A), GLP-1 plasmatic (B), conținutul de insulină pancreatică (C), greutatea corporală (D), masa grasă (%) (E) și conținutul de minerale osoase (F). Observațiile au fost făcute după 40 de zile de tratament la șoareci cu conținut ridicat de grăsimi și cu șoareci martori. Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 8) unde * p ▽ p ▽▽ p 8 GluPAL) apelin-13 amidă, aceasta a fost însoțită de un aport scăzut de energie (p Fig 6.

Efectul i.p. administrarea de liraglutidă, (Lys 8 GluPAL) apelin-13 amidă sau pGlu (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă (fiecare la 25 nmol/kg corp) la consumul de O2 (A, B) și producția de CO2 (C, D). După 36 de zile de tratament, șoarecii au fost plasați în camere metabolice CLAMS timp de 24 de ore pentru a se aclimatiza și încă 24 de ore pentru măsurători (12 ore perioadă întunecată, așa cum este arătat de bara neagră), consumul de O2 și producția de CO2 au fost măsurate timp de 30 sec la 25 intervale min. Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 6) unde * p ▽▽ p Fig 7.

Efectul i.p. administrarea de liraglutidă, (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă sau pGlu (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă (fiecare la 25 nmol/kg corp) pe raportul de schimb respirator (RER, A). După 35 de zile, șoarecii de tratament au fost plasați în camere metabolice CLAMS timp de 24 de ore (12 ore perioadă întunecată, așa cum este arătat de bara neagră). RER a fost calculat prin împărțirea VCO2 la VO2. Sunt incluse, de asemenea, RER mediu (B), RER în cicluri de lumină (C) și întuneric (D). Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 6) unde * p ▽ p ▽▽ p Fig 8.

Efectul i.p. administrarea de liraglutidă, (Lys 8 GluPAL) apelin-13 amidă sau pGlu (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă (fiecare la 25 nmol/kg greutate corporală) pe cheltuială de energie (A). După 35 de zile de tratament, șoarecii au fost plasați în camere metabolice CLAMS timp de 24 de ore (12 h perioadă întunecată așa cum este arătat de bara neagră) și cheltuiala de energie calculată utilizând RER cu următoarea ecuație: (3.815 + 1.232 x RER) x VO2. Sunt incluse, de asemenea, cheltuielile de energie medii (B), cheltuielile de energie în cicluri de lumină (C) și întuneric (D). Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 6) unde * p ▽▽▽ p Fig 9. Efectul i.p o dată pe zi. administrarea de liraglutidă, (Lys 8 GluPAL) apelin-13 amidă sau pGlu (Lys 8 GluPAL) apelină-13 amidă (fiecare la 25 nmol/kg greutate corporală) pe activitatea locomotorie.

După 35 de zile de tratament, șoarecii au fost așezați în camere metabolice CLAMS timp de 24 de ore (12 ore perioadă întunecată, așa cum este arătat de bara neagră). Numărul de activități pe axa X (laterală) (A-D) și axa Z (verticală) (E-F) au fost înregistrate în fiecare minut pe toată durata. Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 6).

În plus față de efectele asupra homeostaziei glucozei (Lys 8 gluPAL) apelină-13 amidă și pGlu (Lys 8 gluPAL) apelină-13 amidă au redus semnificativ aportul de alimente și au evocat pierderi semnificative în greutate corporală. Aceste acțiuni, împreună cu efectele directe discutate mai sus, ar fi, de asemenea, de așteptat să contribuie la îmbunătățirea sensibilității la insulină și a controlului metabolic. Studiile ulterioare care utilizează hrănirea în perechi ar putea ajuta la evaluarea importanței relative a pierderii în greutate corporală, dar sunt dificil de interpretat datorită efectelor „hrănirii mesei” asupra parametrilor investigați. Apelin și receptorii săi APJ au fost detectați în nucleii arcuați și paraventriculari ai hipotalamusului, cunoscuți a fi situri cheie în controlul central al comportamentului de hrănire și al cheltuielilor de energie [34,48]. Apelin ar putea, de asemenea, modifica adipozitatea corpului independent de aportul de alimente prin creșterea cheltuielilor de energie prin activarea proteinelor 1 și 3 de decuplare mitocondriale [49].

De asemenea, este de remarcat faptul că, așa cum s-a observat anterior [34], acești analogi ai apelin-13 (niveluri plasmatice crescute ale GLP-1 total sugerând că secreția crescută a GLP-1 joacă un rol în funcția îmbunătățită a celulelor beta și în homeostazia glucozei. la reducerea aportului alimentar și a pierderii în greutate corporală prin afectări centrale sau acțiune de reducere a golirii gastrice [34]. În mod interesant, șoarecii apelin knockout (KO) prezintă sensibilitate redusă la insulină, intoleranță la glucoză și hiperinsulinemie [50]. sensibilitate la insulină la acești șoareci cu receptori APJ intacti [50], cu efectele sensibilizante la insulină continuând până la 4 săptămâni și fără dovezi de desensibilizare a receptorilor.

La șoarecii alimentați cu conținut ridicat de grăsimi pGlu (Lys 8 gluPAL) apelin-13 amidă a redus colesterolul total la șoarecii hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi. Ambii analogi ai apelinului acizilor grași au avut un efect pozitiv asupra reducerii trigliceridelor circulante, colesterolului LDL, precum și asupra creșterii colesterolului HDL. Beneficiile cardiovasculare ale apelinului, inclusiv reducerea tensiunii arteriale, sunt bine stabilite [51], iar studiile ulterioare ar merita să exploreze astfel de acțiuni în contextul actual. Odată administrat zilnic mimetic GLP-1, liraglutida a reprodus toate beneficiile analogilor apelin-13, dar nu a reușit să îmbunătățească complet profilul lipidic la șoarecii alimentați cu conținut ridicat de grăsimi, așa cum s-a arătat anterior în laboratorul nostru [38]. Mai mult, s-au observat niveluri crescute de amilază circulantă comparativ cu controlul slab și cu conținut ridicat de grăsimi, sugerând reacții adverse care indică pancreatită [52].

Toate grupurile tratate, inclusiv cele care au primit liraglutidă, au prezentat un consum crescut de O2 și producția de CO2, concomitent cu cheltuielile de energie crescute. Acest efect asupra metabolismului întregului corp a fost asociat cu o reducere a masei grase. Raportul mediu de schimb respirator a fost crescut în toate grupurile care reflectă parțial depleția de grăsime, așa cum s-a arătat anterior cu analogii apelinului [34]. Analogii Apelin au fost superiori liraglutidei în îmbunătățirea densității minerale osoase, negând astfel efectul deteriorant al masei grase și al greutății corporale. Interesant, analogii apelinului acizilor grași nu au prezentat modificări ale activității ambulatorii la șoarecii tratați, sugerând că pierderea în greutate a fost independentă de activitate.

Concluzie

În concluzie, studiul de față a arătat că o dată pe zi administrarea (Lys 8 gluPAL) de apelină-13 amidă sau pGlu (Lys 8 gluPAL) apelină-13 amidă ameliorată a diabetului, a evocat pierderea în greutate și a scăzut lipidele circulante la șoarecii hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi, cu efecte similare sau mai bune decât liraglutida. În ansamblu, analogul pGlu (Lys 8 gluPAL) apelin-13 amidă a fost cel mai eficient analog și a fost mai bun decât analogul neacilat testat anterior [34].