Abstract

fundal

Efectele vitaminei D asupra funcției imune a găinilor ouătoare nu sunt bine înțelese. Acest studiu a investigat efectele vitaminei D3 (VD3) asupra performanțelor ouătoare și a funcțiilor imunologice la găinile ouătoare Escherichia coli provocare lipopolizaharidică (LPS).

Metode

În experimentul unu, 360 de straturi de tulpină Jinghong-1 (32 de săptămâni) au fost împărțite aleatoriu în patru grupuri cu șase replici pe grup și 15 găini pe replică. Găinile au fost hrănite cu o dietă bazală suplimentată cu diferite niveluri de VD3 (0; 500; 1500; sau 3000 UI VD3/kg de dietă) timp de 10 săptămâni pentru a determina performanța de ouat, calitatea ouălor și alți parametri. În experimentul doi, 24 de găini ouătoare Jinghong (32 de săptămâni) au fost hrănite cu diete bazale fie cu 0, fie cu 3000 UI VD3/kg de dietă. După 10 săptămâni de hrănire, șase găini din fiecare tratament au fost injectate intravenos cu 8 mg/kg greutate corporală fie LPS, fie ser fiziologic. Probele de sânge și splină au fost obținute pentru analiza parametrilor imuni la 4 ore după injectare.

Rezultate

Deficitul de VD3 a redus producția de ouă și calitatea ouălor; în plus, aportul de furaje și raportul furaj-ou au crescut. Nu au fost observate diferențe semnificative în acești parametri, cu excepția puterii cojii de ouă între nivelurile suplimentare VD3 dietetice la 500; 1500; și 3000 UI VD3/kg de dietă. Deficitul de VD3 a crescut nivelul hormonului seric (calcitonină, hormon paratiroidian, estradiol și progesteron) și al nivelului de citokină (IL-6, IL-10), raportul IFN-γ la IL-4, activitatea mieloperoxidazei și conținutul total de IgG în ser, și a reglat în sus populația de celule T CD3 + din sânge. Receptorul splenic al retinoidului X (RXR), factorul nuclear-κB (NF-κB), oxidul azotic sintaz inductibil (iNOS) și nivelurile de ARNm ale genei receptorului polimeric al imunoglobulinei (pIgR) au fost reglate în sus la găinile cu deficit de VD3. Deficitul de VD3 a redus semnificativ concentrațiile serice de hormon foliculostimulant (FSH) și hormon luteinizant (LH) și numărul de celule T CD4 + CD25 + din sânge. Aceste modificări au fost complet normalizate prin suficiența VD3. LPS a redus concentrația serică de LH, lizozima splenică și nivelul ARNm al genei pIgR. LPS a indus o creștere a nivelurilor totale de IgM serice și a procentului de celule T CD8 + în sânge. Modificările au fost complet inversate prin adăugarea VD3.

Concluzie

Suplimentarea cu VD3 ar putea proteja găinile ouătoare nu numai de deficiența de VD3, ci și de stresul imunologic.

fundal

Găinile ouătoare crescute în condiții comerciale intensive sunt adesea amenințate de cantități mari de tipare moleculare asociate cu agenții patogeni, cum ar fi lipopolizaharidele (LPS) derivate din bacterii gram-negative și acidul lipoteicoic derivat din bacteriile gram-pozitive. S-a sugerat că inhalarea bacteriilor gram-negative din mediu (în special endotoxinele lor) este o problemă majoră de sănătate a păsărilor. Administrarea LPS la pui stimulează sistemul imunitar, activând transcripția factorului nuclear (NF) -κB, eliberând proteine ​​de fază acută și citokine proinflamatorii, determinând expresia receptorilor de tip 2 (TLR2) și 4 (TLR4), precum și a modulației a răspunsurilor anticorpilor [29], pe lângă provocarea simptomelor clinice precum febră, anorexie și scăderea creșterii [29, 30].

Metode

Declarație de etică a animalelor

Acest studiu, care a respectat liniile directoare instituționale și naționale pentru îngrijirea și utilizarea animalelor, a fost aprobat de Comitetul pentru experimente pe animale al Universității Agricole din China. S-au făcut toate eforturile pentru a reduce la minimum suferința animalelor.

Model animal și tratamente experimentale

Analiza citometriei de flux

Analiza calciului seric și a 25-hidroxicolecalciferolului

Conținutul total de calciu seric (mM) a fost măsurat cu spectrofotometrul vizibil UV-2000 (Unico Instruments Co. Ltd., Shanghai, China) folosind truse comerciale de testare colorimetrică (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China).

Pentru a determina 25-hidroxicolecalciferol (25 (OH) D) seric, probele de ser au fost separate prin centrifugare la 894 × g timp de 15 min și congelate la - 20 ° C. Cromatografia lichidă de înaltă performanță - spectrometria de masă tandem a fost utilizată pentru a evalua 25 (OH) D așa cum s-a descris anterior [33]. O curbă standard a fost obținută utilizând diluții ale unui standard 25 (OH) D (Iso Sciences, SUA).

Analiza hormonilor serici

Au fost determinate nivelurile de corticosteron (CORT), calcitonină (CT), hormon paratiroidian (PTH), estradiol (E2), hormon foliculostimulant (FSH), hormon luteinizant (LH), testosteron (T) și progesteron (PG) în ser. cu kituri radioimunologice comerciale (RIA) în conformitate cu instrucțiunile producătorului (Beijing North Institute of Biological Technology, Beijing, China).

Complement seric și analiză de citokine

Mieloperoxidaza serică (MPO), componentele complementului (C3, C4, C5) au fost măsurate utilizând un kit comercial (Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng). Concentrațiile serice de interleukine (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10), interferon-γ (IFN-γ) și factor de necroză tumorală-α (TNF-α) au fost determinate disponibile comercial kituri ELISA de citokine de pui (Beijing North Institute of Biological Technology), conform protocolului producătorului. În fiecare test, o citokină de pui recombinant de control a fost diluată în intervalul de detectare recomandat pentru a genera o curbă standard, iar liniaritatea a fost calculată utilizând Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, SUA) pentru a fi R 2 = 0,99. Concentrațiile probei au fost interpolate din curba standard.

Determinarea IgG totală și IgM serică

Nivelurile serice ale IgG și IgM totale au fost cuantificate cu kituri de pui IgG și IgM ELISA, respectiv (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, SUA), urmând procedura producătorului. Probele de ser au fost diluate 1: 125.000 pentru determinarea IgG sau 1: 10.000 pentru determinarea IgM. Plăcile au fost citite printr-un cititor de plăci ELISA (SepctraMax® i3x Platform, Molecular Devices, LLC, San Jose, CA, SUA) la 450 nm, iar concentrațiile serice de anticorpi au fost calculate utilizând software-ul Gen 5 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, STATELE UNITE ALE AMERICII).

PCR cantitativă în timp real pentru măsurarea nivelurilor de transcripție a genelor legate de imunitate în splină

analize statistice

În experimentul unu, a fost utilizată o replică ca unitate experimentală. Datele au fost supuse ANOVA unidirecționale utilizând procedura GLM a SPSS 17.0 pentru Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, SUA). Mijloacele de tratament au fost separate prin teste multiple Duncan la P

Rezultate

Efectele deficienței VD3 și a insuficienței VD3 asupra producției de ouă și calității ouălor

Rezultatele analizei datelor despre caracteristicile producției sunt prezentate în Tabelul 3; găinile hrănite cu diete fără suplimentarea VD3 au arătat o reducere semnificativă (P 0,05) diferențe în parametrii de mai sus pentru găinile ouătoare între nivelurile suplimentare VD3 dietetice la 500 UI; 1500 UI și 3000 UI/kg de dietă.

În comparație cu VD3, grupul cu deficiență, suplimentarea alimentară VD3 în mod semnificativ (P 0.05) efect asupra unității Haugh, a culorii cojii de ou și a culorii gălbenușului (Tabelul 4). Rezistența ouălor la găinile ouătoare cu 1500 UI și 3000 UI/kg VD3 dietetic a fost semnificativ mai mare decât cea a găinilor hrănite cu 500 UI VD3/kg dietă.

Concentrațiile serice de calciu și 25-hidroxicolecalciferol

A existat o reducere semnificativă a concentrațiilor serice de calciu (2,00 ± 0,98 mg/dl față de 2,28 ± 1,17 mg/dL; P FIG. 1

dietetică

Concentrațiile hormonilor serici

Concentrațiile hormonilor din ser au arătat (Tabelul 5) că nu s-au găsit interacțiuni semnificative de dietă × provocare la nivelurile serice de CORT, CT, PTH, FSH, E2, T și PG: LH a fost excepția. Găinile injectate cu LPS hrănite cu diete suplimentate cu VD3 au prezentat cele mai ridicate niveluri de LH seric (P Tabelul 5 Efectul vitaminei D3 asupra serului biochimic și hormonilor găinilor ouătoare infectate cu LPS *

Comparativ cu găinile injectate cu soluție salină, injecția cu LPS redusă semnificativ (P 0,05) pe PTH și FSH. În comparație cu grupul cu deficit de VD3, suplimentarea alimentară cu VD3 s-a redus semnificativ (P 0,05) la nivelurile serice CORT și T.

Activitatea MPO serică

Așa cum se arată în Tabelul 6, provocarea LPS a dus la un MPO mai mic (P 0,05) comparativ cu celelalte tratamente.

Complement seric, concentrații de IgG și IgM

După cum se arată în tabelul 6, injecția cu LPS a scăzut semnificativ (P 0,05) comparativ cu grupurile cu deficit de VD3.

Populația de limfocite T din sânge

După cum se arată în Tabelul 7, comparativ cu găinile injectate cu soluție salină, injecția cu LPS a redus semnificativ (P +, Celulele T CD4 + și CD8 + din sânge și au crescut semnificativ (P + Celule T CD25 + în urma provocării LPS.

Suplimentarea suficientă cu VD3 a scăzut semnificativ (P + Limfocite T și a crescut populația de celule T CD4 + CD25 + (P + Celulele T din sânge între tratamentul dietetic VD3 și provocarea LPS. Găinile injectate cu LPS alimentate cu diete cu VD3 suplimentar au prezentat cea mai mică (P + Celulele T din sânge comparativ cu celelalte trei grupuri de tratament.

Nivelurile de citokine serice

Pentru a determina dacă VD3 poate exercita un efect antiinflamator la găini, am evaluat efectul VD3 asupra răspunsului inflamator indus de LPS prin măsurarea TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL- Concentrațiile de 6, IL-8 și IL-10 în ser tratate cu LPS cu sau fără VD3. Comparativ cu găinile martor injectate cu soluție salină, injecția LPS în mod semnificativ (P Tabelul 8 Efectul provocării vitaminei D3 și LPS asupra citokinelor serice ale găinilor ouătoare infectate cu LPS *

Expresia genelor legate de imunitatea splenică

Efectele suplimentării dietetice cu VD3 asupra VDR, RXR, TLR-2, TLR-4, NF-κB, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, LYZ, iNOS și pIgR abundența transcrierii genelor în splina găinilor după expunerea la LPS sunt prezentate în Tabelul 9. Nivelurile de expresie ale genelor TLR4, NF-κB și IL-6 au fost remarcabil crescute (P 0,05) nivelurile de expresie ale VDR, TLR-4, TNF-α, IL-1β, IL-6 și IL-8 în splina găinilor comparativ cu găinile neacceptate.

Discuţie

Studiul nostru a arătat că deficiența de VD3 a redus semnificativ performanța de depunere și calitatea ouălor. Cu toate acestea, adăugarea VD3 la 500 UI; 1500 UI; și 3000 UI/kg în dieta bazală s-a raportat că a crescut semnificativ producția de ouă, greutatea ouălor și calitatea ouălor; în consecință, FCR a fost îmbunătățit în comparație cu găinile cu deficit de VD3. Mai mult, găinile hrănite cu diete care conțin 1500 UI și 3000 UI VD3/kg de dietă au avut coji de ou mai puternice decât păsările cărora li s-au administrat 500 UI VD3/kg de dietă. În concordanță cu constatările noastre, rezultate similare privind performanța producției au fost raportate în studiile anterioare [34,35,36], unde rata de producție, greutatea zilnică a ouălor și aportul de furaje nu au diferit. Alte studii [37, 38] nu au raportat diferențe semnificative în ceea ce privește performanța ouării și calitatea ouălor între diferitele niveluri de suplimentare cu VD3 din dietă. Astfel, rezultatele noastre au indicat că o doză suplimentară adecvată de VD3 pentru găinile ouătoare cu fază medie este de 500 până la 3000 UI/kg de dietă. În plus, scăderea producției de ouă și greutatea ouălor, precum și rate mai mari de mortalitate la găinile cu deficit de VD3 s-au datorat probabil modificărilor microbiotei intestinale, influențelor asupra metabolismului lipidelor hepatice și eficienței reduse a utilizării energiei (date nepublicate).

25 (OH) D, este principala formă circulantă a vitaminei D și este utilizată ca indicator al stării vitaminei D [39]. În studiul nostru, concentrația de 25 (OH) D și calciu în ser a fost semnificativ mai mică la păsările cu deficit de VD3 comparativ cu păsările cu VD3 suficiente, ceea ce a fost în acord cu studiile anterioare folosind modele de șoarece [40]. În schimb, concentrațiile de 25 (OH) D au crescut ca răspuns la suplimentarea dietetică cu VD3 în studiul nostru, au fost însoțite de creșterea concentrațiilor serice de calciu, așa cum arată rezultatele altor cercetători la pui [41,42,43]. Rolul VD3 în metabolismul calciului și fosforului este crucial pentru implicarea sa bine documentată în formarea oaselor și a găurilor la găinile cu strat [44]. Rezultatele noastre au arătat că dietele hrănite cu găini fără supliment de VD3 au arătat o reducere semnificativă a producției de ouă, precum și o calitate slabă a ouălor, în timp ce suplimentarea cu VD3 a îmbunătățit în mod semnificativ producția de ouă și grosimea și rezistența cojii de ou. Aceste modificări au fost însoțite de creșterea concentrației serice de calciu și 25 (OH) D, ceea ce înseamnă că deficitul de VD3 ar putea afecta metabolismul calciului și al VD3 și ar perturba procesul de formare a egghellului.

Anticorpii naturali sunt componente esențiale ale sistemului imunitar înnăscut și sunt prezenți în organism fără stimularea antigenică a celulelor B [56]. În studiul nostru, deficiența de VD3 a promovat producția de IgG serică, în timp ce suplimentarea cu VD3 a inversat semnificativ această modificare. Acest lucru este în concordanță cu alte constatări [57] care indică producerea de IgG condusă de celule T reglate în jos VD3 sau producția inhibată de anticorpi prin prevenirea proliferării celulelor B activate [24, 58, 59]. Cu toate acestea, la găinile care nu au fost injectate cu LPS, suplimentarea cu VD3 a fost asociată cu o creștere semnificativă a IgM serice, în timp ce nivelurile mai mici de IgM total au fost observate la găinile injectate cu LPS și hrănite cu suficient VD3. Această observație a sugerat că suplimentarea cu VD3 ar putea fi benefică în îmbunătățirea imunității umorale înnăscute a găinilor crescute într-un mediu necontestat, în timp ce contracarează răspunsul inflamator atunci când se confruntă cu o reacție imunitară inadecvată și exuberantă cauzată de LPS prin inhibarea producției de IgM [60]. Prin urmare, VD3 poate fi un regulator imunitar util în producerea stratului.

Concluzie

Studiul nostru a arătat că deficiența de VD3 a cauzat scăderea producției de ouă, calitatea slabă a egghellului și răspunsurile inflamatorii la găinile ouătoare. Suplimentarea dietetică suficientă cu VD3 ar putea îmbunătăți producția de ouă și calitatea ouălor. Suplimentarea ar putea, de asemenea, să reprime răspunsurile inflamatorii imune cauzate de administrarea LPS sau de deficiența VD3 prin afectarea secreției hormonale reproductive și reglarea căii de semnalizare NF-κB. Astfel, suplimentarea cu VD3 ar putea fi benefică pentru a proteja găinile stratificate atât în ​​prevenirea stresului imunologic, cât și a deficitului de VD3. Ne propunem să investigăm în continuare potențialele mecanisme de acțiune legate de efectul antiinflamator al VD3 la pui.