Departamentul de sănătate umană și științe nutriționale, Universitatea din Guelph, Ontario, Canada

imobilizarea

Corespondență: Sănătate umană și științe nutriționale, Universitatea din Guelph, 491 Gordon St., Guelph, ON N1G 2W1, Canada. E-mail: [email protected]

Corespondență: sănătatea umană și științele nutriționale, Universitatea din Guelph, 491 Gordon St., Guelph, ON N1G 2W1, Canada. E-mail: [email protected]

Departamentul de Kinesiologie, Universitatea McMaster, Hamilton, Ontario, Canada

Departamentul de Kinesiologie, Universitatea McMaster, Hamilton, Ontario, Canada

Departamentul de Kinesiologie, Universitatea McMaster, Hamilton, Ontario, Canada

Departamentul de Kinesiologie, Universitatea McMaster, Hamilton, Ontario, Canada

Departamentul de sănătate umană și științe nutriționale, Universitatea din Guelph, Ontario, Canada

Corespondență: sănătatea umană și științele nutriționale, Universitatea din Guelph, 491 Gordon St., Guelph, ON N1G 2W1, Canada. E-mail: [email protected]

Corespondență: sănătatea umană și științele nutriționale, Universitatea din Guelph, 491 Gordon St., Guelph, ON N1G 2W1, Canada. E-mail: [email protected]

Departamentul de sănătate umană și științe nutriționale, Universitatea din Guelph, Ontario, Canada

Corespondență: sănătatea umană și științele nutriționale, Universitatea din Guelph, 491 Gordon St., Guelph, ON N1G 2W1, Canada. E-mail: [email protected]

Corespondență: sănătatea umană și științele nutriționale, Universitatea din Guelph, 491 Gordon St., Guelph, ON N1G 2W1, Canada. E-mail: [email protected]

Departamentul de Kinesiologie, Universitatea McMaster, Hamilton, Ontario, Canada

Departamentul de Kinesiologie, Universitatea McMaster, Hamilton, Ontario, Canada

Departamentul de Kinesiologie, Universitatea McMaster, Hamilton, Ontario, Canada

Departamentul de Kinesiologie, Universitatea McMaster, Hamilton, Ontario, Canada

Departamentul de sănătate umană și științe nutriționale, Universitatea din Guelph, Ontario, Canada

Corespondență: Sănătate umană și științe nutriționale, Universitatea din Guelph, 491 Gordon St., Guelph, ON N1G 2W1, Canada. E-mail: [email protected]

Corespondență: sănătatea umană și științele nutriționale, Universitatea din Guelph, 491 Gordon St., Guelph, ON N1G 2W1, Canada. E-mail: [email protected]

ABSTRACT

ABREVIERI

S-a demonstrat că uzarea mușchilor scheletici duce la scăderi rapide ale forței musculare, ale masei musculare (1-5) și ale conținutului mitocondrial (6). Deși mecanismele moleculare de reglare a atrofiei musculare rămân slab definite, mitocondriile par centrale pentru aceste adaptări, întrucât uzarea musculară pe termen scurt are ca rezultat o expresie a proteinei mitocondriale mai reduse (7-9), respirație stimulată de adenozin difosfat maxim (ADP) (8) o înclinație crescută pentru emisiile de oxigen reactiv mitocondrial (ROS) (10) și markeri crescuți de stres oxidativ (7, 9, 11-13). În schimb, creșterea conținutului mitocondrial ca rezultat al supraactivării α coactivator 1α (PGC - 1α) a proliferatorului peroxizomului (14-17), sau furnizarea unui antioxidant țintit mitocondrial (18), atenuează atrofia mediată de nefolosire. În total, aceste date sugerează intervenții care îmbunătățesc metabolismul oxidativ mitocondrial sau diminuează stresul redox pot atenua efectele dăunătoare asociate cu uzarea musculară.

Mitocondriile răspund intrinsec la diferite intervenții nutriționale. Suplimentarea cu acids - 3 acizi grași polinesaturați s-a dovedit că modifică compoziția lipidică a membranei mitocondriale a mușchilor scheletici și îmbunătățește sensibilitatea ADP mitocondrială independent de modificările conținutului mitocondrial (19). Acest lucru ar putea fi benefic în contextul atrofiei inutilizării, deoarece mișcarea ADP în matricea mitocondrială și legarea ulterioară a ADP de F0F1 adenozin trifosfat (ATP) sintază, stimulează fosforilarea oxidativă (oxfos) și scade producția de ROS (20), un semnal cunoscut pentru a activa căile atrofice (18). Mai mult, observația că sensibilitatea ADP atenuată a fost asociată cu stresul redox în timpul îmbătrânirii (21) și în urma consumului unei diete bogate în grăsimi (22) susține în continuare noțiunea că este necesară o reacție ADP mitocondrială pentru o sănătate celulară optimă.

MATERIALE ȘI METODE

Participanți și biopsie a mușchilor scheletici

Douăzeci de femei sănătoase, moderate active, au fost recrutate pentru studiu și randomizate la un control (n = 9) sau ω - 3 acizi grași (n = 11) grup suplimentar. Participanții au consumat suplimente care conțin ulei de floarea-soarelui (martor) sau ω - 3 (3 g acid eicosapentaenoic; și 2 g acid docosahexaenoic zilnic) timp de 4 săptămâni înainte și pe tot parcursul protocolului de imobilizare cu un singur picior de 2 săptămâni. Prezentul studiu face parte dintr-o investigație mai amplă, iar participanții au fost toți comparabili în ceea ce privește vârsta, înălțimea, masa, compoziția corpului și starea activității, după cum sa raportat anterior în McGlory și colab. (28).

Pregătirea fibrelor musculare permeabilizate

Fibrele musculare permeabilizate au fost separate la microscop în tampon BIOPS (50 mM MES, 7,23 mM K2EGTA, 2,77 mM CaK2EGTA, 20 mM imidazol, 0,5 mM DTT, 20 mM taurină, 5,77 mM ATP, 15 mM PCr și 6,56 mM MgCl2H2O; pH; 7.1). Fibrele au fost tratate cu 30 μg/ml saponină în timp ce se învârteau pentru a permeabiliza sarcolema și au fost spălate în MIR05 (0,5 mM EGTA, 3 mM MgCl2-6H2O, 60 mM lactobionat de potasiu, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM zaharoză și 1 g/L BSA fără acizi grași; pH 7,1) sau tampon Z [(K - MES) (105 mM), KCL (30 mM), EGTA (1 mM), KH2PO4 (10 mM), MgCL2‐6H2O (5 mM), piruvat (0,005 mM), malat (0,002 mM), BSA (5 mg/ml)] până la analiza respirației sau a emisiilor de H2O2.

Respirația mitocondrială în fibrele musculare permeabilizate

Emisia de H2O2 în fibrele musculare permeabilizate

Emisia de H2O2 mitocondrială în fibrele musculare permeabilizate a fost efectuată fluorometric la 37 ° C în prezența tamponului Z, blebistatină (5 µM; MilliporeSigma, Burlington, MA SUA), superoxid dismutază (40 U/ml; MilliporeSigma), roșu ampllex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) și peroxidază de hrean (0,5 U/ml; MUliporeSigma). Adăugarea de succinat (20 mM) a stimulat emisia de H2O2 în prezența sau absența ADP (100 μM). Experimentele au fost efectuate în duplicat și mediat. Toate fibrele au fost uscate și datele au fost corectate pentru greutatea pachetului.

Digestia fibrelor și Western blot

Analize statistice

Comparațiile inițiale între control și suplimentarea ω - 3 înainte de imobilizare au fost determinate folosind probele unui student independent t Test. Rezultatele în cadrul controlului sau ω - 3 - grupuri suplimentate în timpul imobilizării au fost analizate folosind analize ANOVA cu măsuri repetate într-o stare dietetică, urmate de Student - Newman - Keuls post hoc teste, după caz. Cinetica Michaelis - Menten a fost determinată folosind software-ul Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, SUA). Semnificația statistică a fost determinată ca P sem .

REZULTATE

Suplimentarea ω - 3 previne reducerile induse de imobilizare în oxphos

În absența suplimentării cu ω - 3, deși nici respirația scurgerii (absența ADP), nici raporturile de control respirator nu au fost modificate în timpul imobilizării, refuzul muscular a atenuat rapid respirația cuplată mitocondrială. Mai exact, persoanele care au primit supliment de control au prezentat o reducere de ~ 20% a respirației stimulate de ADP după 3 zile de imobilizare, un răspuns care nu a fost exacerbat în continuare după 14 zile (FIG. 1A). Deși 3 zile nu au fost suficiente pentru a detecta o reducere a proteinelor oxfos mitocondriale, 14 zile de imobilizare au redus conținutul mai multor subunități ale lanțului de transport al electronilor, independent de modificările PGC-1α, PGC-1β sau ATP sintază (Fig. 1).B). Combinate, aceste date sugerează că imobilizarea afectează rapid capacitatea respiratorie mitocondrială.

Spre deosebire de control, suplimentarea cu ω-3 a împiedicat această scădere mediată de uzură în capacitatea oxphos, ca respirație stimulată de ADP (Fig. 1C) și conținutul de proteine ​​mitocondriale (Fig. 1D) nu au fost diferite pe parcursul celor 14 zile de imobilizare. Având în vedere că proteinele dinamicilor mitocondriale DRP-1 și MFN-2 sunt implicate în atrofia uzării musculare (15), am examinat apoi dacă diversele răspunsuri la conținutul mitocondrial ar fi asociate cu markeri cheie de fisiune și fuziune. Am constatat că, deși controlul și suplimentarea ω-3 nu au modificat semnificativ expresia proteinei DRP-1 sau MFN-2, raportul MFN-2/DRP-1 a fost mai mic în timpul imobilizării sub control, dar nu și a condițiilor ω-3 (FIG. 2A, B). În ansamblu, aceste date sugerează că consumul de ω - 3 a atenuat sau a împiedicat scăderea capacității oxphos și a dinamicii mitocondriale exprimarea proteinelor asociate în mod normal cu imobilizarea pe termen scurt.

Suplimentarea ω - 3 previne reducerea indusă de imobilizare a ratei de respirație stimulată de ADP submaximală

Având în vedere că concentrațiile de ADP ale mușchilor scheletici în repaus nu sunt saturați, am examinat apoi respirația stimulată de ADP submaximală și sensibilitatea ADP în timpul imobilizării. În conformitate cu ratele maxime de respirație la participanții care au primit supliment de control (Fig. 1A), imobilizarea a redus ADP - respirația stimulată la un interval de concentrații submaximale de ADP după 3 și 14 zile (FIG. 3A). În schimb, participanții care au primit suplimente ω - 3 au avut respirație submaximală similară pe tot parcursul imobilizării (Fig. 3B). Aceste constatări ω - au avut loc independent de modificările km aparent estimate pentru ADP în ambele grupuri în timpul imobilizării (FIG. 4A, B), deși student t testul a arătat că participanții care au primit suplimente ω - 3 au avut o sensibilitate mai mare la ADP la începutul perioadei de imobilizare (P

Imobilizarea a crescut conținutul de proteine ​​antioxidante independent de ratele de emisie de H2O2 sau de peroxidarea lipidelor după control sau suplimentarea ω - 3

Deoarece ROS derivat mitocondrial a fost implicat în pierderea musculară mediată de imobilizare (18) și este influențat de transportul ADP în matricea mitocondrială (20), am examinat în continuare capacitatea ADP de a suprima emisia de H2O2 mitocondrială. În mod surprinzător, indiferent de intervenția dietetică, imobilizarea nu a crescut capacitatea de emisie H2O2 mitocondrială în absența sau prezența ADP. Mai mult, imobilizarea nu a atenuat capacitatea ADP de a suprima emisia de H2O2 mitocondrială (FIG. 5A, B). În plus, 4HNE (adică., peroxidarea lipidelor) nu a fost crescută după imobilizare, iar ambele grupuri dietetice au prezentat enzime antioxidante crescute SOD2 și catalază după 14 zile de dezactivare muscularăFIG. 6A, B). Împreună, aceste date sugerează că H2O2 mitocondrial și stresul redox nu au contribuit la răspunsurile divergente observate la imobilizare după suplimentarea ω - 3.

Imobilizarea nu a modificat indicii metabolismului lipidic

Ca o explicație alternativă pentru efectele benefice ale suplimentării cu ω-3, am examinat, de asemenea, markerii metabolismului lipidic și ai cineticii CPT-I după imobilizare. Consumul de suplimente ω - 3 nu a modificat dramatic răspunsul diferitelor proteine ​​implicate în metabolismul lipidic, deoarece, indiferent de dietă, ATGL a crescut după 14 zile de imobilizare, în timp ce conținutul de proteine ​​de transport al grăsimilor (CD36, FABPpm, FATP4 și CPT- I) și un marker al metabolismului lipidelor mitocondriale (β - HAD) nu au fost modificate (FIG. 7A, B). Doar proteina DGAT a afișat un răspuns divergent pe baza suplimentării, deoarece această proteină a crescut doar după imobilizarea în starea de control (Fig. 7C, D). Având în vedere răspunsurile relativ similare în conținutul de proteine ​​între diete, am examinat respirația mitocondrială susținută de lipide. La participanții care au primit control sau suplimentarea ω-3, imobilizarea nu a modificat respirația susținută de P-CoA (FIG. 8A, B). Mai mult, deși M-CoA a dus la reducerea preconizată a respirației (P

DISCUŢIE

În prezenta investigație, oferim dovezi că imobilizarea unilaterală a membrelor rapid (3 zile) a redus respirația mitocondrială stimulată de ADP maximă și submaximală. Demonstrăm în continuare că suplimentarea cu ω - 3 PUFA (3 g acid eicosapentaenoic; 2 g acid docosahexaenoic) a împiedicat aceste răspunsuri respiratorii mitocondriale, oferind în același timp dovezi că emisia crescută de H2O2 mitocondrială și markerii stresului oxidativ nu au apărut în timpul utilizării musculare pe termen scurt. În ansamblu, aceste date contestă cerința creșterii stresului redox mediat mitocondrial ca o cauză a efectelor dăunătoare asociate cu simpla (adică., mediatie nondisease) uzare musculară evidențiind în același timp potențialul de suplimentare ω - 3 pentru a păstra bioenergetica mitocondrială a mușchilor scheletici.

Imobilizarea și capacitatea mitocondrială

Capacitatea oxfosului mitocondrial a fost implicată în atrofia mediată de uzura musculară, deoarece 7 zile de repaus de pat strict (6) și 14 zile de imobilizare a membrelor reduc masa musculară, forța musculară și conținutul mitocondrial (1). În schimb, reglarea în sus a conținutului mitocondrial prin supraexpresia PGC-1α previne aceste răspunsuri (14-16). În studiul de față, oferim dovezi că respirația mitocondrială într-o serie de concentrații de ADP biologic relevante a fost rapid atenuată de 3 zile de imobilizare a membrelor în grupul suplimentat cu control. În mod curios, deși reducerea respirației după 14 zile de imobilizare a fost asociată cu o pierdere a proteinelor oxphos, acestea nu au fost reduse după 3 zile, în ciuda unei diminuări similare a respirației. În ciuda reducerii respirației și a proteinelor oxphos mitocondriale, imobilizarea nu a modificat conținutul de proteine ​​CPT-I, respirația stimulată de P-CoA sau capacitatea M-CoA de a suprima respirația, sugerând răspunsuri lipidice mitocondriale conservate în condițiile de neutilizare. Cu toate acestea, respirația susținută de lipide reprezintă aproximativ 25% din respirația maximă stimulată de ADP și, prin urmare, este puțin probabil să fie afectată de conținutul mitocondrial.

Având în vedere că dinamica mitocondrială este implicată în reglarea conținutului mitocondrial, iar o creștere a DRP-1 este asociată cu degradarea proteinelor mitocondriale în timpul uzării musculare (15), raportul mai mic al MFN-2/DRP-1 după control, dar nu cu suplimentarea ω-3 sugerează o mai mare activare a proceselor de fisiune în timpul imobilizării. Prin urmare, datele noastre sugerează că activarea fluctuației proteinelor mitocondriale a fost inițiată rapid în favoarea pierderii proteinelor; cu toate acestea, este posibil ca îndepărtarea subunităților mitocondriale să dureze mai mult de 3 zile. Mai mult, efectul benefic al suplimentării cu ω - 3 asupra proteinelor dinamicii mitocondriale stabilite în alte modele dietetice (29-31) ar putea fi o explicație potențială pentru respirația mitocondrială menținută și exprimarea proteinelor în timpul imobilizării. Combinate, aceste date evidențiază plasticitatea și remodelarea rapidă a mitocondriilor în asociere cu uzarea musculară și indică doar 3 - d de uzare este suficientă pentru a reduce funcția respiratorie mitocondrială.

Imobilizarea și sensibilitatea ADP mitocondrială

Imobilizare și emisie mitocondrială - ROS

CONCLUZII

În general, oferim noi dovezi că suplimentarea cu ω - 3 a prevenit tulburările mitocondriale după 14 zile de imobilizare. De asemenea, oferim o perspectivă asupra faptului că reducerile mediate de imobilizare ale bioenergeticilor mitocondriale sunt influențate rapid de refuzul muscular (încă din 3 zile), iar o creștere a stresului redox mediat mitocondrial poate să nu fie necesară pentru scăderea conținutului sau funcției mitocondriale în timpul imobilizării. În paralel cu un raport anterior la acești participanți (28), conținutul mitocondrial conservat, funcția și metabolismul lipidelor în timpul imobilizării pot contribui la menținerea masei musculare și a forței ca răspuns la suplimentarea ω - 3.

MULȚUMIRI

P.M.M. a fost susținut de o bursă absolventă a Consiliului de Cercetare în Științe Naturale și Inginerie (NSERC) și un premiu doctoral Ontario Health Health Scholars Scholarship (OWHSA). CM. a fost sprijinit de burse de cercetare de la Diabetes Canada și Societatea Europeană pentru Nutriție Clinică și Metabolism. Această cercetare a fost finanțată de NSERC (către G.P.H.) și Institutele canadiene de cercetare în sănătate (către S.M.P.). Autorii declară că nu există conflicte de interese.

CONTRIBUȚIILE AUTORULUI

P. M. Miotto și G. P. Holloway au conceput scopurile de cercetare și experimentele pentru studiul actual; C. McGlory și S. M. Phillips au conceput procesul de imobilizare; P. M. Miotto a efectuat experimente, a analizat date și a pregătit cifre; C. McGlory, R. Bahniwal și M. Kamal au efectuat procesul de imobilizare; P. M. Miotto și G. P. Holloway au elaborat manuscrisul; iar toți autorii au editat și au aprobat versiunea finală a manuscrisului.