Articolul de cercetare - Cercetare biomedicală (2018) Volumul 29, numărul 12

Studiați efectul bacteriilor probiotice izolate din alimente asupra agenților patogeni

Abeer Abu Zaid 1.2 *

1 Departamentul special pentru alimentație și nutriție, Institutul de cercetare a tehnologiei alimentare, Centrul de cercetări agricole, Giza, Egipt

2 Departamentul de Biologie, Facultatea de Științe, Universitatea Taif, Arabia Saudită

* Autor corespondent: Abeer Abu Zaid
Departamentul de Biologie
Facultate de Stiinte
Universitatea Taif, Arabia Saudită

Data acceptată: 26 februarie 2018

Vizitați pentru mai multe articole similare la Cercetări biomedicale

Abstract

Unsprezece tulpini de Bacillus au fost izolate din alimente și evaluate pentru potențialul probiotic și siguranța lor. Apoi studiați efectul tulpinilor selectate împotriva agenților patogeni și asupra populației de agenți patogeni din laptele degresat reconstituit (RSM). Șapte tulpini de la Bacillus sp. (3) și Bacillus subtilis (4) au fost selectate care au crescut cu pH scăzut de la 1,0 la 5,0 și sare biliară tolerantă de la 0,3 la 2%, foarte rezistente la condițiile simulate ale tractului gastro-intestinal și au prezentat activitate antimicrobiană împotriva Salmonella typhimurium ATCC20231 și Staphylococcus aureus ATCC25923. Aveau susceptibilitate la antibiotice împotriva a 6 antibiotice testate. De asemenea, este expus non-hemolitic pe sângele de oaie. Doi agenți patogeni au fost complet inhibați după 60 și 72 de ore de incubare cu tulpini probiotice selectate în RSM. Rezultatele indică faptul că Bacillus subtilis sau Bacillus sp. ar putea fi folosit ca culturi probiotice pentru hrana animalelor și legume umane, fermentate, lapte, produse din carne, precum și pentru a realiza conservarea biologică a produselor lactate în industriile alimentare.

Cuvinte cheie

Tulpini probiotice, Bacillus sp., Antibacteriene, Antibiotice, Afecțiuni ale tractului gastro-intestinal

Introducere

Boala transmisibilă de alimente este o problemă de sănătate internațională majoră la nivel mondial și a redus creșterea economică, deși a îmbunătățit performanța unui control legislativ eficient asupra procedurilor de procesare a alimentelor în industrii [1]. Bolile diareice transmise prin alimente sunt cauze de boală și deces

2,2 milioane de persoane anual și peste 200 de tipuri de boli transmise de alimente [2,3]. Acești agenți patogeni sunt Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi., Bacillus cereus, drojdii și mucegaiuri. Utilizarea agenților antimicrobieni produși în mod natural fără efecte adverse asupra sănătății umane pentru a inhiba propagarea microorganismelor patogene în alimente, ceea ce poate constitui o provocare pentru problemele asociate cu contaminarea alimentelor.

Expresia „probioticelor” era plagiată de la cuvântul grecesc, înseamnă „pentru viață” [4]. După aceea, probioticele au fost definite ca: „Microorganisme vii” care, atunci când sunt administrate în cantități suficiente, conferă o sănătate benefică gazdei prin îmbunătățirea echilibrului său microbian în intestin [5,6]. Bacteriile probiotice pot produce diverși metaboliți antimicrobieni, care includ acizi organici (acizi lactici și acetici) și bacteriocine. Acizii organici nu numai că scad pH-ul, dar pot fi toxici și pentru agenții patogeni. Beneficiile bacteriilor probiotice sunt prevenirea și tratamentul bolilor în tulburările gastrointestinale, cum ar fi dizenteria, diareea, tifoida [7].

Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus, Leuconostoc, Bacillus și multe altele sunt integrate în lista probioticelor [8]. Probioticele sunt bine recunoscute pentru a poseda proprietăți specifice, cum ar fi; toleranța sucului gastric și a bilei, aderența la celulele epiteliale ale intestinului, supraviețuiesc în tractul gastro-intestinal al oamenilor și animalelor și îmbunătățirea echilibrului microbian intestinal [9].

Bacteriile probiotice, precum microorganismele obișnuite, pot avea proprietăți nedorite, cum ar fi apariția unor factori nocivi biochimici și de virulență. Acestea nu sunt formatoare de spori și pot fi distruse în concentrații biliare ridicate ale duodenului și acizilor stomacali. Prin urmare, un număr mare de bacterii probiotice a fost necesar să supraviețuiască în intestin anaerob. Pentru a contesta această problemă, sunt în curs numeroase studii cu privire la aplicabilitatea unui nou spor care formează probiotice Bacili, cum ar fi; Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus polymyxa și Bacillus mesentricus. Acestea sunt nepatogene și se găsesc în mod natural în apă și sol, fermentează un număr mare de zaharuri, secretă enzime de protează, lipază și amilază, supraviețuiesc în stomac și ajung în intestin pentru a germina și sunt stabil termice.

Speciile de bacili sunt bacili Gram pozitivi, produc spori rezistenti la căldură și răspândiți în mediu sau în multe tipuri de alimente. B. subtilis nu dăunează mamiferelor, inclusiv oamenilor, și este importantă din punct de vedere comercial ca producător de substanțe chimice și enzime foarte ridicate și o cantitate diversă de metaboliți secundari precum antibioticele, precum și proteine ​​heterologice, antigene și vaccinuri [7,10,11 ]. B. subtilis crește eficient cu surse de carbon și azot ieftine, deoarece enzimele sale sunt foarte eficiente descompunând o mare varietate de proteine, carbohidrați și lipide de origine animală și vegetală, în unitățile lor constitutive [12]. Sporii B. subtilis au capacitatea de a rezista condițiilor extreme de pH, iradiere UV, temperaturi ridicate, solvenți și perioade lungi de timp de depozitare fără refrigerare [13]. În revizuire, B. subtilis are adaptabilitatea utilizării nutrienților în creștere, produce un nivel ridicat de enzime, secreție de compuși antimicrobieni, se dezvoltă în condiții aerobe și anaerobe și B. subtilisis este recunoscută în general ca fiind sigură (GRAS) de către Food and Drug Administration (FDA). )). În cele din urmă, B. subtilis în „teorie” poate fi bine măsurat ca o bacterie probiotică multifuncțională ideală pentru gazde [11,14-17].

Scopul acestui studiu este de a evalua potențialele proprietăți probiotice ale bacteriilor Bacillus izolate din alimente și efectele lor antibacteriene împotriva patogeniei. În cele din urmă, studiați efectul co-cultivării bacteriilor probiotice cu patogen în laptele degresat.

Material si metode

Tulpini bacteriene

Unsprezece tulpini bacteriene (M01-M11) au fost izolate în condiții aerobe din douăsprezece produse alimentare tradiționale; în plus, toate tulpinile au fost identificate prin secvențierea parțială a genei 16SrARN și analiza filogenetică. Toate tulpinile au fost identificate prin 97-100% identitate, inclusiv circulația Bacillus (4), Bacillus sp. (3) și Bacillus subtilis (4), conform lui Zaid [18]. În urma evaluării standard au fost efectuate teste biochimice standard, cum ar fi reacția gram, formarea sporilor, motilitatea, reacția catalazei, activitatea oxidazei, hidroliza esculinei [19].

Potențial probiotic

Toleranță pH: Izolatele au fost inoculate în tuburi sterile din bulion de nutrienți (NB) cu pH variabil, adică 1,2, 3, 4 și 5 incubate la 37 ° C timp de 24 de ore. Apoi, 0,1 ml de inoculuri din fiecare tub au fost turnate sub formă de mediu nutritiv agar prin metoda turnării plăcii și incubate la 37 ° C timp de 48 de ore. Creșterea bacteriilor pe agar a fost utilizată pentru a desemna izolatele ca fiind tolerante la pH [7].

Toleranță la sare biliară

Mediul cu concentrații variate de sare biliară (0,3, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 și 4,0%) a fost inoculat cu fiecare cultură bacteriană selectată și incubat la 37 ° C timp de 48 de ore. Apoi, 0,1 ml de inoculi au fost transferați în agar nutrienți prin metoda plăcii de turnare și incubate la 37 ° C timp de 48 de ore. Creșterea bacteriilor pe placa de agar a fost utilizată pentru a desemna izolatele ca tolerante la sare biliară [7].

Activitate hemolitică

Pentru testarea activității hemolitice, izolatele au fost striate pe plăcile de agar Columbia; conținând 5% (g/v) sânge de oaie [20].

Sensibilitatea la antibiotice

Tulpinile selectate de Bacillus au fost evaluate pentru sensibilitatea la antibiotice utilizând metoda de difuzie a agarului pe agar Mueller Hinton [21]. Antibiotice precum ampicilina (Am 10 U); penicilină (P 10 mg); acid nalidixic (NA, 30 μg); vancomicină (V, 30 μg); colistină (CS, 10 μg); tetraciclină (T, 10 μg); Gentamicină (GM, 10 mg); Acid fusidic (FA, 10 U). Toate antibioticele au fost achiziționate de la Bio-Rad, Laboratories, GmbH., Germania. Izolează suspensia de cultură care conține

10 6 cfu/ml din cultura de 18 ore la 37 ° C, apoi striat pe agar de un tampon steril de bumbac. Discurile antibiotice studiate au fost așezate aseptic pe plăci. Diametrele zonei de inhibare au fost calculate în mm sub contorul coloniei după 24 ore de incubare.

Efectul afecțiunilor gastro-intestinale simulate

Conform lui Zago și colab., Au fost concepute condiții gastrointestinale simulate [1]. Creșterea izolatelor la pH 2,0 în prezența 1% lizozimă, 1% tripsină și 0,3% lamelă biliară în bulion de soia triptic (TSB) a fost utilizată pentru a desemna izolatele ca condiții gastro-intestinale simulate.

Activitate antimicrobiană

Pentru detectarea activității antagonismului, s-a folosit un test la fața locului de agar [22]. Culturile peste noapte, pe mediu NB, ale tulpinilor care urmează să fie testate pentru producerea compusului antimicrobian au fost centrifugate (10 minute la 15000 g, 4 ° C). Supernatantele fără celule au fost filtrate peste filtrul de acetat de celuloză (0,2 μm) pentru a îndepărta celulele reziduale. O cultură peste noapte (37 ° C) a tulpinii țintă a fost diluată în mediu Mueller-Hinton steril și 1 ml de 106 CFU a fost împrăștiat pe mediu solid Mueller-Hinton. Vasele Petri au fost uscate timp de 10 min. Sondă de plută a fost folosită pentru perforarea unei găuri, cu diametrul de 4,1 mm. Agar nutritiv a fost folosit pentru a sigila fundul găurilor. Probele (30 μL) de supernatante fără celule filtrate au fost transferate pe placa de agar. Tulpinile țintă utilizate în acest studiu sunt Salmonella typhimurium ATCC20231 și Staphylococcus aureus ATCC25923.

Efectul co-cultivării bacteriilor probiotice cu patogene

Această metodă a fost utilizată pentru a studia efectul bacteriilor probiotice asupra populației de patogeni din laptele degresat reconstituit (RSM). 9 ml de RSM au fost inoculați cu 1 ml de cultură peste noapte de bacterii probiotice și 0,1 ml de patogen. Mediul RSM inoculat a fost amestecat bine și incubat la 37 ° C timp de 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 h. În urma incubației, populația de alterări și bacterii patogene a fost numărată pe agar nutritiv [23].

analize statistice

studiați

Figura 1: Efectul co-culturii cu bacterii probiotice în mediile de lapte degresat reconstituit asupra populației log de Salmonella typhimurium.

Figura 2: Efectul co-culturii cu bacterii probiotice în mediile de lapte degresat reconstituit asupra populației log de Staphylococcus aureus.

Staphylococcus aureus a fost mai rezistent în prezența Bacillus subtilis și Bacillus sp., S-a inhibat complet după 72 de ore de incubație. Tulpinile de Bacillus circulan au un comportament de control similar celui arătat din rezultate și strică toate probele după 48 de ore de perioade de incubație. Aceeași constatare a lui Denkova și colab. a ajuns la concluzia că E. coli și Salmonella au fost sensibile la prezența bacteriilor probiotice și în timpul cultivării articulare, inhibarea completă până la 60 a 72 h h de incubație [23]. Pe de altă parte, Staphylococcus aureus a arătat mai rezistent la prezența bacteriilor probiotice în mediu, dar acest agent patogen a fost sensibil la Bif. Numai tulpina Bifidum.

În concluzie, șapte tulpini (4 Bacillus subtilis și 3 Bacillus sp.) Nu au prezentat activitate hemolitică (hemoliză γ), activitate antibacteriană, au tolerat un pH scăzut 2,0, sare biliară până la 0,3%; viabil sub stresul tractului gastrointestinal stimulat (SGIT). Aceste tulpini sunt puternic sugerate a fi utilizate ca probiotice și pot fi măsurate în general recunoscute ca bacterii sigure (GRAS). Celelalte patru tulpini de la Bacillus circulan au capacitatea de a hemoliza incompletă (hemoliza α) și au pierdut unul dintre criteriile importante (toleranța la acid și la bilă). Acesta ar putea fi concluzionat prin combinarea diferitelor tulpini probiotice pentru a completa inhibarea creșterii bacteriilor și sporilor. În urma studiilor efectuate, tulpinile de Bacillus subtilis și Bacillus sp. a avut o activitate antimicrobiană ridicată, este important ca aplicarea acestor tulpini probiotice în alimente să prelungească termenul de valabilitate. Tulpinile de probiotice Bacillus au fost utilizate pentru producerea de alimente funcționale (iaurt; bioyurt; pâine cu termen de valabilitate extins; produse din carne uscată crudă; brânzeturi; conservarea organică a cremelor cosmetice).