Pavel Seredin

1 Departamentul de Fizică și Nanostructuri ale Statului Solid, Universitatea de Stat Voronezh, Voronezh, Universitatea Sq. 1, 394018, Rusia

2 Ural Federal University, 19 Mira Street, Ekaterinburg, 620002, Rusia

Dmitry Goloshchapov

1 Departamentul de Fizică și Nanostructuri ale Statului Solid, Universitatea de Stat Voronezh, Voronezh, Universitatea Sq. 1, 394018, Rusia

Yuri Ippolitov

3 Departamentul de Medicină Dentară Pediatrică cu Orthodontia, Universitatea de Stat din Medicina Voronezh, Voronezh, str. Studentcheskaya. 11, 394006, Rusia

Jitraporn Wongsvivut

4 Sincrotron australian (Sursă de lumină sincrotron Australia Pty LTD), 800 Blackburn Rd, Clayton, VIC 3168, Australia

Abstract

Scopul lucrării noastre este de a găsi o semnătură spectroscopică a proceselor patologice ale dentinei carioase pe baza investigațiilor privind compoziția moleculară a fluidelor biologice orale cu utilizarea tehnicilor de sincrotron FTIR. Această analiză complexă a datelor obținute arată că o serie de semnături sunt prezente numai în spectrele dentinei și fluidelor gingivale de la pacienții care dezvoltă cariile țesuturilor dentine profunde. Caracteristicile detectate și analiza complexă a datelor cantitative și calitative care reprezintă semnături ale dezvoltării patologiilor cavității bucale pot spori calitatea screeningului dentar.

1. Introducere

Creșterea calității vieții este o tendință prioritară în progresul național pentru orice țară dezvoltată. În cadrul acestei tendințe, studiul dezvoltării bolilor cavității bucale cauzate de procesele cariogene sunt de mare importanță datorită efectului direct al cariilor asupra sănătății umane și asupra activității profesionale [1,2].

Rămâne problema diagnosticării eficiente personalizate a bolilor țesuturilor dentinei profunde, care este semnificativă și nerezolvată, deoarece procesele inflamatorii din dentină pot duce nu numai la pierderea părții unui dinte sau chiar a întregului dinte, ci și la mai mult probleme grave care amenință sănătatea umană în general [3-5].

Reacția naturală a dentinei la atacul cariat, în special în stadiile incipiente ale dezvoltării patologiei, este centrul unor cercetări de ultimă generație [3,5,6]. În prezent, aceste modificări pot fi controlate în principal printr-un set de tehnici de analiză rapidă bazate pe analiza salivei [7-9] și lichidul crevicular gingival [10,11] sau factori inflamatori conform analizei serice [12-14]. Cu toate acestea, aceste fluide biologice nu sunt în contact direct cu dentina, iar modificările compoziției lor pot apărea din cauza bolilor sistemice umane, a infecțiilor și traumatismelor și a rezultatului diferiților stimuli [15-18].

Un candidat ideal pentru rolul unui nou obiect de screening ar putea fi lichidul dentinic, care joacă un rol important în dezvoltarea cariilor dentinei [19]. Lichidul dentinic este un derivat al plasmei sanguine, conținând proteine ​​serice, imunoglobuline și substanțe minerale dizolvate [20]. Lichidul dentinar se deplasează din pulpa dentară, umple canalele dentinare proliferate ramificate, circulă în interiorul acestora și interacționează activ cu țesutul dentinei. Intruziunea bacteriană în canalele dentare are loc ca rezultat al smaltului dentar compromis și al integrității cimentului [21,22]. În acest caz, metaboliții bacterieni se difuzează prin tubulii dentari și determină dezvoltarea proceselor patologice în țesuturile dentare profunde [19]. Astfel, este foarte probabil ca lichidul dentinic însuși și markerii proceselor patologice din țesuturile dentare dure conținute să poată pătrunde în sulul gingival prin tubulii dentinici și astfel să se amestece cu lichidul din sul, care este transudatul seric [19]. Investigațiile anterioare au arătat că un set caracteristic de proteine ​​și alte molecule poate fi detectat în lichidul dentinic, indicând dezvoltarea unei patologii, infecție sau avansarea procesului inflamator în țesuturi [4,20,23].

Din păcate, utilizarea lichidului dentinic pentru diagnosticarea dezvoltării patologiei în țesuturile dentare profunde la om este foarte complicată. Principala complexitate a unei astfel de abordări diagnostice este un algoritm dificil care implică extragerea lichidului dentinic, în special în cazul cariilor fisurale, atunci când este necesar să se determine dacă apar procesele inflamatorii în dentină. Caracteristicile neexpediente și non-etice ale acestei proceduri sunt evidente atunci când se ia în considerare începutul procesului cariat și absența faptelor care confirmă inflamația din dentina dentară.

Extragerea lichidului crevicular gingival pentru diagnosticarea patologiei dentinei este mult mai simplă și analiza moleculară a acesteia, cu o selecție de markeri care indică dezvoltarea proceselor carioase/patologice ale dentinei, poate fi efectuată utilizând tehnici de identificare moleculară [10,11,24]. Prin urmare, pare rezonabil să se aplice spectroscopia cu infraroșu (IR) ca o tehnică puternică de analiză expresă și un instrument informativ și precis pentru studierea compoziției moleculare și de fază a obiectelor biologice [22]. Identificarea markerilor de prognostic și de validare pentru dezvoltarea proceselor patologice este o zonă separată de interes printre problemele rezolvate cu ajutorul transformatei Fourier IR (FTIR). Spectroscopia IR poate fi utilizată pentru a determina nivelurile parodontitei [11,25] și tendința apariției cariilor și pentru a monitoriza dezvoltarea acesteia [7]. Pe baza datelor de microspectroscopie IR, pare posibil să se examineze schimbările în compoziția moleculară a fluidelor biologice din cavitatea bucală în dezvoltarea patologiei.

Literatura de specialitate nu conține nicio informație privind comparația compoziției moleculare a dentinei și a fluidelor gingivale, în timpul modificărilor patologice ale dentinei pentru a releva semnături spectroscopice, adică markeri ai patologiei.

Prin urmare, am căutat o semnătură spectroscopică a proceselor patologice ale dentinei carioase pe baza investigațiilor FTIR ale sângelui, dentinei și fluidelor gingivale, precum și am determinat potențialul lor de diagnostic pentru screeningul preventiv al patologiilor cavității bucale.

2. Materiale și metode de investigație

2.1 Proiectarea experimentelor

Zece participanți (5 bărbați și 5 femei) cu vârste cuprinse între 22 și 28 de ani au participat la studiu. Toți participanții au fost sănătoși și nu au luat antibiotice, medicamente, nu au fumat și nu au băut băuturi alcoolice. Toți participanții nu au înregistrat în buletinele lor medicale timp de 1 an înainte de începerea experimentului. La examinare, fiecare participant a avut dinți cu focare de leziune legate de cariile primare și secundare în etapa corespunzătoare codului 1 și 2 conform Sistemului internațional de detectare și evaluare a cariilor (ICDAS). Participanții au postit 12 ore și nu au băut lichide timp de cel puțin 2 ore înainte de prelevarea de probe a fluidelor lor biologice. După curățarea preliminară a cavității bucale, fluidele biologice au fost prelevate la 10-12 AM pentru a minimiza efectele ritmului circadian. Au fost obținute trei probe de lichid biologic fiecare participant: lichid dentinic, lichid sulcus gingival și sânge.

2.2 Tehnica de prelevare a probelor

Luând în considerare experiența unui număr de studii în care efectul capilar a fost utilizat pentru obținerea microvolumelor de lichid din sulul gingival, am pregătit sfaturi speciale pentru investigațiile noastre. Am prelevat probe de lichide biologice folosind aceste sfaturi (Fig. 1 (a) –1 (c)).

patologice

Microcapilar pentru prelevarea de probe a fluidelor biologice. (a) Un capilar cu suprafețele umplute cu (1) KBr pur, (2) filtru nețesut și (3) țeavă de adaptare pentru microburet. (b) Un exemplu de eșantionare a lichidului de sul gingival. (c) Configurare experimentală pentru studierea probelor de fluid biologic obținute (HYPERION 3000).

Tipul aplicat reprezintă un microcapilar cu un diametru extern de 800 μm și a fost umplut cu pulbere de bromură de potasiu omogenizată (KBr) care a fost densificată folosind un filtru nețesut (Fig. 1 (a)). KBr a fost utilizat ca purtător inert al fluidului investigat, în timp ce alegerea sa ca umplutură s-a bazat pe absența benzilor de absorbție într-un interval larg de spectru IR.

Microcapilarul a fost atașat la o seringă sterilizată. O diferență de presiune în microcapilară a fost produsă fie de instrumentul cu piston al seringii atașate, fie ca urmare a utilizării unei instalații de evacuare. Când s-a atins valoarea necesară a diferenței de presiune, atunci fluidul biologic a intrat în KBr.

2.3 Pregătirea probelor

2.3.1 Lichid dentinic

Așa cum s-a indicat mai sus, la examinare, fiecare participant a avut dinți suspiciuni pentru caria suprafeței smalțului. Nu s-au observat semne evidente de parodontită sau dezvoltare a gingivitei.

Dezvoltarea procesului cariat în dinți a fost detectată pe baza abordării noastre realizate anterior, în care microaziunile țesuturilor dentare dure au demonstrat un randament de fluorescență mai mare decât zonele smalțului intact datorită dezorientării inițiale a cristalelor de apatită [26].

Participanții cu carie detectată după separarea cofferdamului unui dinte au fost pregătiți atât pentru smalț, cât și pentru dentină folosind un vârf de aer cu micromotor al unui tungsten sferic dopat - burghiu dentar din oțel vanadiu care se rotește la 4000 rpm.

După crearea unei fisuri în suprafața masticatorie a dintelui până la deschiderea dentinei, s-a observat stratul infectat de mineralizare de dentină gălbuie. Ulterior, dacă examinarea a confirmat dezvoltarea cariilor dentinei, lichidul dentinic a fost prelevat din cavitatea pregătită folosind un tip microcapilar și instalația de evacuare ALP-02. Aici, a fost realizată o etanșare ermetică pe suprafața masticatorie a dintelui pregătit folosind glanda de cauciuc, iar această construcție a fost atașată la instalația de evacuare. Acest lucru ne-a permis să generăm presiune negativă sub glanda de cauciuc de aproximativ 0,9 atm/cm2 și astfel proba de lichid dentinic ar putea fi obținută în cel mult 1 minut.

2.3.2 Fluid sulcus gingival

Lichidul gingival a fost prelevat de la fiecare participant din sulcusul gingival al aceluiași dinte din care a fost prelevat lichidul dentinic. Aici, participantul a clătit cu atenție cavitatea bucală preliminar. Apoi, pentru a izola zona de prelevare, dinții au fost tăiați din zonele vestibulare și orale cu tampoane de bumbac sterile. Zona de prelevare a fost uscată cu aer de la un compresor fără ulei. Lichidul sulcus gingival a fost apoi prelevat cu ajutorul unui microcapilar așa cum se arată în Fig. 1 (b) .

2.3.3 Sânge

Sângele a fost prelevat de la fiecare participant din același sul gingival în urma prelevării de lichide gingivale. Sulful gingival a fost intubat folosind o sondă sterilă și o picătură de sânge a fost prelevată folosind un microcapilar.

2.4 Configurarea echipamentului și scanarea probelor

După prelevare, pulberea KBr din microcapilarele care conțin fluide biologice a fost uscată la temperatura camerei și apoi examinată utilizând microspectroscopie IR (IRM).

Compoziția moleculară a lichidului dentinic, a lichidului gingival și a sângelui a fost investigată utilizând spectroscopie IR și echipamente IRM (Synchrotron, Victoria, Australia), cu un spectrometru Bruker VERTEX 80v cuplat cu un microscop Hyperion 3000 FTIR (Fig. 1 (c)) și un detector cu telurură de mercur cadmiu (MCT) cu bandă îngustă răcită cu azot lichid (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Germania) [27]. Toate spectrele sincrotron FTIR au fost înregistrate într-un interval spectral de 3800-700 cm -1 la rezoluție spectrală de 4 cm -1. Apodizarea pe 3 termeni a lui Blackman-Harris, corectarea fazei Mertz și factorul de umplere zero de 2 au fost setate ca parametri impliciți de achiziție utilizând suita software OPUS 7.2 (Bruker Optik GmbH).

Pentru măsurarea transmisiei sincrotron FTIR, bucăți mici de probă pulbere au fost transferate și presate între o pereche de ferestre de celule de microcompresie diamantate (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia), împreună cu o bucată mică de pulbere KBr folosită ca referință de fond IR [ 27]. Datele spectrale au fost achiziționate în modul de transmisie folosind un obiectiv obiectiv 36x (diafragmă numerică (NA) = 0,50; Bruker Optik GmbH), o dimensiune a focalizării fasciculului de 6,9 ​​μm diametru și opt scanări co-adăugate pe spectru. Spectrele de fundal au fost achiziționate pe KBr, care a fost bine separat de proba sub formă de pulbere în interiorul aceleiași celule de comprimare a diamantului, folosind 32 scanări adăugate.

Conform FTIR, sistemul investigat este slab afectat de impactul extern; prin urmare, informații despre compoziția moleculară a probei pot fi obținute fără modificări ca urmare a expunerii la iradiere [7,12,14,27].

2.5 Analiza spectrală

Prelucrarea spectrală a datelor, graficarea graficelor, toate manipulările spectrului (eliminarea fundalului și corectarea condițiilor atmosferei), media spectrelor și integrarea datelor și toate calculele au fost efectuate folosind suita software profesională OPUS (versiunea 7.2, Bruker Optik GmbH). Pentru a netezi datele spectrale, a fost aplicat un filtru-polinom Savitzky-Golay de ordinul doi peste cinci puncte de date.

3. Rezultate experimentale și discuții

Datele experimentale obținute de IRM au demonstrat că spectrele probelor de același tip ale participanților cuprindeau absolut unul și același set de moduri de vibrație. Mai mult, aceste spectre s-au diferit unele de altele în mod nesemnificativ doar prin modificări ale intensității benzii de vibrații. Spectrele probelor medii pe grupurile de participanți sunt prezentate în Fig. 2 și toate celelalte calcule au fost efectuate pe baza analizei spectrelor medii. Procedura de mediere a spectrelor asupra grupului experimental permite în cele din urmă eliminarea erorilor experimentale aleatorii și a trăsăturilor individuale ale participanților dintr-un anumit grup [3].

Comparația spectrelor IR în intervalul 2200–850 cm −1 de fluide gingivale și dentine și sânge în medie pentru grupurile participante.

Figura 2 prezintă spectrele IR ale dentinei și fluidelor gingivale și ale sângelui. Spectrele IR au fost interpretate pe baza datelor din studiile anterioare care au studiat probe de fluide biologice din cavitatea bucală, precum și proteine ​​și aminoacizi, utilizând FTIR [16,17,28-34].

Primul și cel mai intens grup de vibrații, dispuse la 1725–1190 cm -1, este atribuit proteinelor. Benzi de amide secundare ar putea fi separate între aceste grupuri: Amida I (vibrații de întindere C = O în intervalul 1725–1590 cm −1), Amidă II (curbă N - H și întindere C - N în 1590–1500 cm −1 și Amida III (întindere C - N, curbă N - H în intervalul 1350–1190 cm −1), precum și vibrațiile grupurilor CH2/CH3 dispuse la 1480–1350 cm −1 [25,34-36 ].

Următorul grup mare de benzi de vibrații localizate în intervalul 3600 cm - 2800 cm -1 este legat de prezența grupelor moleculare atribuite derivatelor proteinelor din probe (α-amilază, albumină, cistatine, mucine) și lipide și grăsimi acizi [7,16,17].

Al treilea grup de vibrații din spectrele IR, dispuse la 1130–900 cm -1, este atribuit legăturilor moleculare legate de fosfați, glicerofosfați și fosfolipide [37,38] și de carbohidrați și derivați ai structurilor ADN. În timp ce acest grup de benzi de vibrații cuprinde mai multe seturi de vibrații legate de o componentă minerală (derivați ai fosforului) pentru probele de dentină și lichid gingival, proba de sânge a inclus moduri de intensitate redusă aranjate în acest interval spectral. Aceste moduri sunt atribuite grupurilor moleculare de carbohidrați și derivați ADN.

Împreună cu principalele grupuri descrise de moduri de intensitate mare, au fost observate mai multe benzi în spectrele probelor, iar intensitatea lor a fost mult mai mică decât cea din primele trei grupuri. Cu toate acestea, apariția lor în spectre este o semnătură a proteomicii unui fluid biologic specific și dezvoltarea unui proces patologic în cavitatea bucală.

O atenție specială trebuie acordată spectrelor IR ale celor trei fluide biologice în următoarele intervale spectrale: 2200–1800 cm -1, 1765–1725 cm -1, 1171–1160 cm -1 și vibrațiile din aceste regiuni.

Primul grup de vibrații în intervalul 2200-1800 cm -1 a fost observat numai în spectrele dentinei și fluidelor gingivale. Aceste benzi pot fi atribuite tiocianaților [7,31,32,39], care sunt indicatori ai proceselor patologice din cavitatea bucală. Conținutul lor este crescut în cariile și bolile parodontale [7]. În ciuda calității de înaltă precizie a eșantionării, am observat, de asemenea, vibrații de intensitate redusă ale dioxidului de carbon (CO2) absorbite pe fluidele gingivale și dentine și serul sanguin în acest interval spectral. Cu toate acestea, intensitatea vibrațiilor în intervalul 2098-2065 cm -1 atribuită tiocianaților observate în spectrele dentinei și fluidelor gingivale a fost mult mai mare decât intensitatea modului CO2.

Pentru al doilea grup de vibrații IR în intervalul 1765–1725 cm −1, datele anterioare [25,40] arată că această bandă spectrală poate fi atribuită vibrației complexului> C = O și poate fi legată de carboxilic grupul unui ester (ester carbonil). Prezența esterilor în țesutul dentar dur al unui om, cum ar fi în cariile dentare, a fost demonstrată anterior [25,40]. Autorii acestor lucrări au indicat faptul că esterii sunt mai des prezenți în țesutul cariat decât în ​​țesutul intact [41].

A treia bandă de vibrații observată în intervalul 1171–1160 cm -1 din spectrele IR este atribuită carbohidraților, iar creșterea nivelului lor în fluidele orale indică dezvoltarea procesului cariat, așa cum am demonstrat anterior [7]. În timp ce glucidele nu au fost detectate în eșantionul de sânge, nivelurile lor în dentină și fluide gingivale au fost destul de ridicate.

4. Analiza și discuția rezultatelor obținute

Pe baza datelor FTIR și a unei abordări testate în lucrările noastre anterioare [37,42], am comparat compoziția moleculară a dentinei și a fluidelor gingivale și a sângelui. Anterior [37,42], am arătat că estimarea matematică a compoziției moleculare a fluidelor biologice umane poate fi efectuată pe baza calculelor și analizei diferitelor relații (coeficienți) dintre componentele organice și minerale ale probei de fluid. Aplicând abordarea propusă, este foarte convenabil să utilizați următorii coeficienți.

Primul coeficient, R1 (Amida II/Amida I), poate fi calculat din raportul intensității integrate a benzii Amide II (întindere CN, vibrații de îndoire NH) în intervalul 1600-1458 cm −1 cu cea a Amidei Banda I (C = vibrații de întindere O) în intervalul 1720–1600 cm −1.

Al doilea coeficient, R2 (Tiocianat/Proteină), propus anterior [39], poate fi calculat din raportul intensității integrate a benzii de vibrații −N = C = S, dispus la 2100–2050 cm −1 și atribuit tiocianatului, la cea a benzilor Amide (Amide I și Amide II) în intervalul 1720–1485 cm −1.

Relația R3 (Ester/Amida I) este determinată de raportul dintre intensitatea integrată a grupului carboxilic al esterului complex (ester carbonil) în intervalul 1740–1710 cm −1 cu cea a benzii Amidei I (C = O întindere) în intervalul 1720–1600 cm −1.

Aceste relații au fost calculate utilizând OPUS 7.2 (Bruker) și au implicat un set larg de capabilități funcționale pentru procesarea și estimarea datelor spectroscopiei IR. Figura 3 prezintă rezultatele calculelor pentru coeficienții R1 - R3.