Heather K. Smith

1 Departamentul Sport și Știința Exercițiului, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă,

Kenneth G. Matthews

2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,

Jenny M. Oldham

2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,

Ferenc Jeanplong

2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,

Shelley J. Falconer

2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,

James J. Bass

3 Institutul Liggins, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă,

Mônica Senna-Salerno

2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,

Jeremy W. Bracegirdle

2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,

Christopher D. McMahon

2 AgResearch Ltd., Centrul agricol Ruakura, Hamilton, Noua Zeelandă,

Conceput și proiectat experimentele: CDM HKS KGM JMO FJ JJB. Au efectuat experimentele: KGM CDM JMO SJF MSS JWB. Am analizat datele: CDM HKS JMO SJF JWB. Am scris lucrarea: CDM HKS FJ KGM.

Abstract

Analizele Western Blot

O probă de 150 mg de mușchi gastrocnemius lateral a fost omogenizată în 1 ml tampon de liză (10 mM Hepes, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl, pH 7,9) cu 0,5% detergent IGEPAL (Sigma, MO, SUA) și un inhibitor enzimatic (complet, Roche Diagnostics). Probele au fost omogenizate pe gheață, apoi centrifugate la 11.000 × g timp de 10 minute. Supernatantul a fost recuperat, amestecat cu tamponul de încărcare Laemmli [55], fiert timp de 5 minute, apoi depozitat la –20 ° C până la analiză. Concentrația de proteine ​​a supernatantului a fost determinată utilizând testul acidului bicinchoninic (Sigma-Aldrich NZ, Auckland, NZ).

m 7 GTP-sepharose Cromatografie

Pentru a verifica dacă starea de fosforilare a 4E-BP1 reflectă legarea la eIF4E, am folosit rășină m7 GTP-sepharose 4B pentru a izola și a evalua starea legată a acestor proteine ​​pentru o comparație încărcată (ziua 0) și descărcată (ziua 2) ca anterior descris [56], [57]. Pe scurt, rășina m7 GTP-sepharose 4B (GE Healthcare Ltd, Auckland, NZ), a fost spălată de două ori cu tampon de liză (descris mai sus) și 80 μl de suspensie de 50% a fost amestecat cu 300 μg de supernatant din mușchiul gastrocnemius omogenizat și se lasă să se incubeze peste noapte la 4 ° C. După centrifugare la 13.000 × g și trei spălări în 1 ml tampon de liză, materialul legat a fost resuspendat într-un volum egal de 2x tampon de încărcare Laemmli. Western blot a fost efectuată prin încărcarea a 30 μl de probă pe geluri SDS-PAGE de 10% (eIF4E) sau 15% (4E-BP1). Membranele au fost blocate așa cum s-a descris anterior și 4E-BP1 a fost detectat prin incubarea cu anticorp anti-iepure anti-4E-BP1 (112000, Cell Signaling Technology Inc), în timp ce eIF4E a fost detectat prin incubare cu anticorp monoclonal anti-eIF4E de șoarece (1∶2000, # sc9976, Santa Cruz Biotechnology Inc) peste noapte. Detectarea a fost cea descrisă mai devreme.

Evaluarea izoformelor cu lanț greu de miozină

Dimensiunea fibrei musculare

Analize statistice

Masa umedă a mușchilor a fost exprimată în raport cu masa corporală inițială pe d0. Datele au fost supuse analizei varianței folosind GenStat versiunea 13 (VSN International Ltd) cu factori de genotip (Mstn (-/-) sau de tip sălbatic), ziua și interacțiunea lor incluse în declarația modelului. Comparații multiple post-hoc au fost efectuate folosind metoda lui Tukey [61]. Datele sunt prezentate ca mijloace și eroarea standard a mediei (sem).

Rezultate

Șoarecii din ambele genotipuri au pierdut masa corporală în timpul HS și au recuperat masa corporală în măsuri similare în timpul reîncărcării (P Figura 1). Toți mușchii recoltați de la șoareci Mstn (-/-) au pierdut masă musculară în timpul HS, în timp ce numai soleusul șoarecilor de tip sălbatic a pierdut masă în timpul HS. Masa musculară pierdută de la șoarecii Mstn (-/-) a fost în mare parte restabilită după 7 zile de reîncărcare. Cu toate acestea, masa mușchilor B. femoris și Quad a Mstn (-/-) nu a fost recuperată complet prin reîncărcarea d7 (Figura 2). Pierderea relativă (~ 20%, P Figura 2).

semnalizare

Spre deosebire de litere denotă diferențe semnificative (P Figura 3A și 3B). Cu toate acestea, a existat o pierdere mai mare a MyHC de tip IIb în Mstn (-/-) în comparație cu șoarecii de tip sălbatic (efectele zilei P Figura 3C).

Asteriscurile denotă diferențe între genotipuri în zilele prezentate (** P Figura 6. A existat o abundență mai mare de 4E-BP1 total la nivelul mușchilor șoarecilor Mstn (-/-) comparativ cu cei de la șoarecii de tip sălbatic (P Figura 7) Abundența 4E-BP1 fosforilată a fost semnificativ diferită între cele două genotipuri doar la d8, a fost redusă la ambele genotipuri la d2, a crescut la d7 (d8 în Mstn (-/-)) și apoi a scăzut pentru restul reîncărcării. raportul dintre 4E-BP1 fosforilat și total a fost mai mic înainte de HS și a rămas mai mic pe toată durata HS și fazele de reîncărcare în mușchii gastrocnemius ai Mstn (-/-) comparativ cu șoarecii de tip sălbatic (Figura 7). în ambele genotipuri. O creștere ulterioară în ziua 8 și recuperarea treptată în timpul reîncărcării a fost evidentă (efectele zilei P 7 GTP sepharose pentru a izola și îmbogăți în mod specific 4E-BP1 legat de eIF4E pentru zilele 0 și 2 pentru comparație între o stare încărcată și una descărcată .Conform cu unsoarea Abundența totală a 4E-BP1, care a dat naștere la un raport mai mic de fosforilat la 4E-BP1 total (Figura 7), a existat mai mult 4E-BP1 legat de eIF4E la mușchii Mstn (-/-) comparativ cu tipul sălbatic șoareci înainte de HS și acest raport a crescut după 2 zile de HS în ambele genotipuri (efectele zilei P Figura 8).

Asteriscurile denotă diferențe semnificative între genotipuri în zilele indicate (* P 7 GTP-sepharose pull-down test în mușchiul gastrocnemius al Mstn (-/-) și șoarecii de tip sălbatic (n = 6 pe genotip și zi) înainte și după două Au existat efecte principale ale zilei (P Figura 9). Abundența eIF2α fosforilată nu a fost diferită între genotipuri și a crescut în timpul HS și în primele trei zile de reîncărcare, apoi a scăzut în mușchii șoarecilor de tip sălbatic la d14 (Figura 9) Ca și în cazul 4E-BP1, raportul dintre eIF2α fosforilat și total a fost mai stabil decât abundența proteinelor totale sau fosforilate și nu a diferit între genotipuri. Raportul a crescut (P Figura 9).

Asteriscurile denotă diferențe semnificative între genotipuri în zilele indicate (*** P Figura 10). Raportul dintre rpS6 fosforilat și total nu a diferit între genotipuri și a crescut (P Figura 10).

Concluzionăm că mușchii scheletici ai șoarecilor Mstn (-/-) sunt mai sensibili la atrofia indusă de HS decât cei ai șoarecilor de tip sălbatic, dar se recuperează la reîncărcare. Arătăm, de asemenea, că proporția mai mare de MyHC de tip IIb în mușchii șoarecilor Mstn (-/-) este în acord cu susceptibilitatea mai mare a acestor miofibre la atrofie în timpul descărcării. Speculăm că o combinație a unei creșteri tranzitorii a degradării proteinelor prin sistemele ubiquitin-proteazom și autofagie-lizozomală, împreună cu o reducere susținută a mecanismelor sintetice proteice (în special cea a 4E-BP1 mai mare) stau la baza susceptibilității mușchilor Mstn ( -/-) șoareci la atrofia indusă de descărcare. Expresia crescută a miogeninei și MyoD poate proteja miofibrele care conțin o proporție mai mare de proteină MyHC de tip IIb în mușchii șoarecilor Mstn (-/-). Inversarea acestor mecanisme poate contribui la recuperarea mai rapidă a masei musculare la șoareci Mstn (-/-) în timpul reîncărcării.

Din aceste constatări, propunem că antagoniștii pentru miostatină nu pot fi o terapie benefică în timpul fazei de atrofiere a mușchiului scheletic, dar pot fi benefice în timpul fazei de recuperare, unde mușchiul este încărcat activ. Mai mult, datele noastre sugerează că miostatina ar putea fi o terapie de administrat în timpul atrofiei induse de descărcare, pentru a proteja în special fibrele cu contracție rapidă - o perspectivă care este probabil controversată și se îndepărtează de dogma actuală [7]. În ciuda acestui comentariu, alții au arătat că administrarea receptorului solubil de activină 2B reduce gradul de atrofie musculară în timpul cașexiei, ceea ce, poate, evidențiază faptul că alți membri TGF-β sunt activați în diferite condiții patologice până la atrofia indusă [83].

Mulțumiri

Mulțumim lui Ric Broadhurst, Bobby Smith și Glenda Smith pentru îngrijirea șoarecilor din Colonia Animalelor Mici. Mulțumim, de asemenea, Dr. Neil Cox pentru analiza statistică.

Declarație de finanțare

Această cercetare a fost susținută de un grant de la Marsden Fund, o divizie a Societății Regale din Noua Zeelandă. Finanțatorul nu a avut nici un rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.