• Ecran divizat
  • Pictogramă Partajare Acțiune
    • Facebook
    • Stare de nervozitate
    • LinkedIn
    • E-mail
  • Pictogramă Instrumente Instrumente

    • Kanako Wakahashi, Kentaro Minagawa, Yuko Kawano, Hiroki Kawano, Tomohide Suzuki, Shinichi Ishii, Akiko Sada, Noboru Asada, Mari Sato, Shigeaki Kato, Kotaro Shide, Kazuya Shimoda, Toshimitsu Matsui, Yoshio Katayama; Recunoașterea vitaminei D - diferențierea înclinată mediată a macrofagelor inițiază mielofibroza și osteoscleroza ulterioară. Sânge 2019; 133 (15): 1619–1629. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2018-09-876615

      recunoașterea

      Descărcați fișierul de citare:

      Puncte cheie

      Macrofagele a căror diferențiere este distorsionată de semnalizarea VDR sunt factorii cheie pentru miofibroblaste in vivo.

      Macrofagele și VDR pot fi ținte terapeutice în mielofibroza condusă de JAK2V617F.

      Rezumat vizual

      Abstract

      Introducere

      Cromozomul Philadelphia - neoplasmele mieloproliferative negative (MPN) includ policitemia vera (PV), trombocitemia esențială (ET) și mielofibroza primară (PMF). Aproape toți pacienții cu PV și mai mult de jumătate dintre pacienții cu ET și PMF poartă o mutație somatică a JAK2 V617F în celulele hematopoietice. 1,2 O caracteristică comună a MPN este o fază hipercelulară inițială și, într-o fază ulterioară, modificarea fibrotică a măduvei osoase (BM), care este un semn predictiv pentru progresia ulterioară către splenomegalie masivă și incidența crescută a transformării leucemice. 3 inhibitori JAK pot reduce dimensiunea unei spline mărite, dar nu sunt eficienți în inversarea mielofibrozei și prevenirea transformării leucemice. 4,5 Aceasta indică prezența unor căi necunoscute care determină mielofibroza la pacienții cu MPN, altele decât activarea constitutivă JAK-STAT.

      Mielofibroza se caracterizează prin ocuparea spațiului măduvei cu celule stromale pozitive (α-SMA +) ale actinei musculare α-fusiforme, așa-numitele miofibroblaste, împreună cu acumularea de fibre de colagen care pot apărea cu colorare cu argint. 3 Studii recente au arătat că miofibroblastele cauzatoare de fibroză au fost derivate din anumiți precursori ai stromului mezenchimal (Gli1 + și receptorul leptinei - pozitiv [LepR +]) și un factor determinant major pentru acest proces de proliferare/diferențiere este dovedit a fi anumiți factori produși în principal de megacariocite cum ar fi factorul de creștere transformant-β1 (TGF-β1) și factorul de creștere derivat din trombocite (PDGF). 6-8

      O caracteristică unică a mielofibrozei în MPN este aceea de a fi un însoțitor frecvent al osteosclerozei, 3 o îngroșare și neregularitate a osului trabecular, a cărui patogenie este în mare parte necunoscută. În stadiul avansat al mielofibrozei, spațiul măduvei este înlocuit de țesuturile de colagen și oasele trabeculare, ceea ce sugerează că miofibroblastele prezintă o funcție asemănătoare osteoblastelor și mielofibroza poate fi considerată o osificare a măduvei.

      S-a demonstrat că macrofagele măduvei susțin puternic celulele descendente mezenchimale. 9-11 În special, OsteoMac-urile asociate oaselor joacă roluri importante pentru supraviețuirea și activitatea osteoblastelor prin cel puțin, parțial, producerea de factori de susținere, cum ar fi oncostatina M și factorul de necroză tumorală-α. 10-14 Epuizarea macrofagelor, inclusiv OsteoMacs, duce la dispariția ulterioară a osteoblastelor. 11,12 Pe baza funcției critice a macrofagelor pentru celulele mezenchimale angajate în osteolineage, am speculat că macrofagele ar putea juca un rol semnificativ în proliferarea miofibroblastelor producătoare de colagen în țesuturile fibrotice ale măduvei.

      Aici, arătăm că mielofibroza depinde în mod critic de macrofage a căror diferențiere este distorsionată de semnalizarea receptorului de vitamina D (VDR) utilizând modelele de mielofibroză ale MPN-urilor noastre originale și JAK2V617F.

      Materiale și metode

      Șoareci și probe de biopsie BM umană

      Eșantioanele de biopsie BM ale pacienților umani cu MPN cu sau fără mielofibroză severă, care au fost colectate în scopul diagnosticului, au fost utilizate pentru imunohistochimie cu consimțământul informat în scris sau cu o abordare de renunțare sub aprobarea comisiei de revizuire instituțională la Universitatea Kobe (numărul de aprobare 1455). Vârsta, sexul și diagnosticul au fost după cum urmează: UPN1, 75 de ani, femeie, PV; UPN2, 73 de ani, bărbat, PMF; UPN3, 72 de ani, bărbat, ET; UPN4, 75 de ani, femeie, ET; UPN5, 54 de ani, femeie, sindrom mielodisplazic/MPN; UPN6, 59 de ani, bărbat, sindrom mielodisplazic/MPN; UPN7, 63 de ani, femeie, PV (sub tratament cu hidroxiuree); și UPN8, 78 de ani, bărbat, ET.

      Transplantul BM

      Șoarecii himerici au fost generați prin injectarea venei cozii a 2 × 106 celule nucleate BM donatoare CD45.1-WT (BMNC) în iradiere letală (14 Gy, 2 doze divizate cu interval de 3 ore) VDR +/+ sau VDR -/- șoarecii crescuți pe o dietă bogată în calciu, printre care primitorii VDR -/- au fost denumiți modelul de bază al mielofibrozei. Sângele a fost colectat lunar pentru a evalua numărul de celule sanguine și reconstituirea de către celulele donatoare a fost confirmată de chimerismul CD45.1/CD45.2 al leucocitelor din sângele periferic. De asemenea, am testat 2 × 10 6 BMNC de la șoareci VDR -/- (crescuți pe o dietă bogată în calciu) și 1 × 10 5 CD45 + linie - c-kit + celule sortate din șoareci WT CAG-EGFP Tg (crescuți pe o dietă normală )) ca celule donatoare. Beneficiarii VDR +/+ și VDR -/- au fost hrăniți cu o dietă bogată în calciu chiar și după transplant.

      BMNC (5 × 106 celule) de la șoareci VDR +/+, VDR +/+/JAK2V617F Tg (VDR +/+ JAK) sau VDR -/-/JAK2V617F Tg (VDR -/- JAK) dietă de calciu) au fost transplantate la destinatarii WT (CD45.2) (crescuți pe o dietă normală). Beneficiarii au fost hrăniți cu o dietă normală și după transplant. Sângele a fost colectat lunar pentru a evalua numărul de celule sanguine, iar organele precum BM și splina au fost recoltate la 3 luni după transplant.

      Epuizarea in vivo a macrofagelor

      CD45.1 BMNC (1 × 107 celule) au fost transplantate în iradiere letală (11 Gy) (14 Gy a fost prea dur pentru șoarecii model de bază cu tratament ulterior cu clodronat], 2 doze divizate) VDR -/- șoareci primitori. Lipozomii sau vehiculul clodronat (lipozomi de control) (clodronateliposome.org, Haarlem, Olanda) au fost injectați intraperitoneal în ziua 3 (200 μL), ziua 5 (100 μL) și ziua 7 (100 μL), după ziua 7 (100 μL), urmată de 100 μL la fiecare 4 zile până la 1 lună când femurele primitoare au fost recoltate.

      analize statistice

      Toate datele au fost combinate din cel puțin 3 experimente independente. Imunohistochimia și colorarea cu imunofluorescență au fost prezentate ca date reprezentative a 3 experimente independente care au arătat tendințe similare. Toate numerele eșantionului (n) reprezintă replici biologice. Toate valorile centrale afișate în grafice se referă la medie. Toate valorile au fost raportate ca eroare standard medie plus sau minus a mediei (SEM). Analiza statistică a fost realizată utilizând analiza Kaplan-Meier, testul Student t cu două cozi nepereche, testul analizei varianței unidirecționale (ANOVA) cu procedura post hoc Tukey și coeficientul de corelație Pearson. Nu au fost excluse din analiză eșantioane sau animale și nu au fost utilizate estimările dimensiunii eșantionului. Animalele au fost repartizate aleatoriu în grupuri. Studiile nu au fost efectuate în orb, cu excepția tuturor analizelor histologice. Semnificația statistică a fost evaluată cu Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) și definită ca șoareci P -/- prin transplant de BM normal

      Nivelul sanguin al PTH, precum și forma activă a vitaminei D [1,25 (OH) 2D3], este extrem de ridicat la receptorii VDR -/- 15 (Tabelul 2 suplimentar) și este bine cunoscut faptul că hiperparatiroidismul secundar este asociată cu fibroza măduvei la om. 19 Cu toate acestea, nu a fost cazul în modelul nostru, deoarece șoarecii himerici generați prin transplantul de celule VDR -/- BM în destinatari VDR -/- au supraviețuit în mod normal (Figura 2A) și nu au prezentat mielofibroză/osteoscleroză (Figura 2B) cu celule sanguine normale (Figura 2C), sugerând că mielofibroza în modelul de bază a fost critic asociată cu semnalizarea VDR în celulele hematopoietice. În plus față de măduva femurală, fibroză similară a fost observată și în BM trabeculară a coloanei vertebrale (Figura 5 suplimentară) și a coastelor (datele nu sunt prezentate). Toate aceste zone reprezintă situri specifice pentru celulele hematopoietice imature pentru localizarea și inițierea repopulării hematopoietice după transplant. 20 Colectiv, datele noastre sugerează că VDR +/+ HSC transplantate au obținut BM trabecular la șoarece cu un nivel ridicat de 1,25 (OH) 2D3 și au dispărut după declanșarea dezvoltării mielofibrozei/osteosclerozei.

      Țesuturile fibrotice au fost compuse din macrofage derivate din donatori și miofibroblaste derivate din receptor

      VDR și macrofagele sunt ținte terapeutice pentru mielofibroză în modelul de bază

      Deoarece macrofagele au fost derivate din celulele VDR +/+ BM și miofibroblastele au fost deficitare în VDR în acest model de bază, am emis ipoteza că macrofagele a căror diferențiere a fost distorsionată de semnalizarea VDR au favorizat mielofibroza. Pentru a testa această idee, am hrănit modelul de șoareci de bază cu o dietă săracă în vitamina D. În mod surprinzător, o dietă scăzută în vitamina D a împiedicat creșterea nivelului plasmatic de 1,25 (OH) 2D3 și mielofibroză/osteoscleroză (Figura 4A; Tabelul suplimentar 2). În plus, nu a fost observată nicio reducere a celulelor hematopoietice imature în BM și a celulelor hematopoietice mature din sângele periferic în modelul de bază (Figura 4B; Figura suplimentară 11A-B). Deoarece unii șoareci primitori de VDR au prezentat diaree și mortalitate semnificativă (Figura 4B), intestinul șoarecilor VDR -/- ar putea avea o toleranță scăzută la o dietă scăzută de vitamina D.

      Apoi am epuizat macrofagele prin injectarea lipozomului de clodronat (Figura suplimentară 12A-B). Acest tratament nu a redus numărul de megacariocite (Figura suplimentară 12C-D). Deși osteoscleroza nu a fost salvată eficient prin această metodă, probabil datorită efectului ca bifosfonat, mielofibroza a fost clar prevenită (Figura 5A-B). Astfel, semnalizarea VDR în celulele hematopoietice imature și diferențierea/proliferarea ulterioară a macrofagelor sunt necesare pentru progresia mielofibrozei (Figura 5C).

      VDR și macrofagele sunt ținte terapeutice pentru mielofibroza condusă de JAK2V617F

      Apoi, am încercat să testăm ipoteza că macrofagele și semnalizarea VDR ar putea juca, de asemenea, roluri semnificative în mielofibroză într-un model de mouse de MPN-uri bazate pe JAK2V617F. Am crescut șoareci JAK2V617F Tg cu o dietă săracă în vitamina D după înțărcare. Acești șoareci nu au prezentat diaree sau mortalitate semnificativă. Deși nu s-a observat nicio îmbunătățire a numărului de celule din sânge (Figura 6A), BM la șoarecii TAK JAK2V617F în vârstă de 5 luni au arătat o reducere semnificativă a mielofibrozei atunci când au fost hrăniți cu o dietă scăzută de vitamina D, ceea ce a dus la scăderea plasmatică 1,25 (OH) Nivelul 2D3 (Figura 6B-D). Au fost observate mai multe variații în gradul de osteoscleroză, dar în general nu a fost semnificativă (Figura 6D).

      Măduva fibrotică a șoarecilor transplantați VDR +/+ JAK conținea atât monocite CD68 +/macrofage cât și celule runx2 + osteolineage (Figura suplimentară 13D), iar numărul de macrofage și megacariocite din măduvă a fost comparabil între VDR +/+ JAK și VDR -/- Șoareci transplantați JAK BM (Figura suplimentară 14A-B). Pentru a evalua rolul macrofagelor în mielofibroza condusă de JAK2V617F, am folosit modelul de șoarece MaFIA Tg, în care promotorul receptorului CSF1 direcționează expresia unui receptor de sinucidere bazat pe Fas, ligand (AP20187), în celulele genealogice mononucleare ale fagocitelor, inclusiv OsteoMac, macrofagele măduvei asociate oaselor. 12.17 Am generat șoareci dubli Tg JAK2V617F și MaFIA prin încrucișarea ambelor tulpini și transplantarea BM în șoareci WT iradiați letal. Epuizarea macrofagelor prin injecție în serie a AP20187 la șoareci himerici care adăposteau JAK2V617F BM aproape complet abrogat dezvoltarea mielofibrozei (Figura 7E-F; Figurile suplimentare 15 și 16A-B) fără reducere a megacariocitelor BM (Figura 7G; Figura 16C suplimentară), numărul de celule sanguine și dimensiunea splinei (Figura suplimentară 17). În mod colectiv, macrofagele a căror diferențiere este posibil distorsionată de semnalizarea VDR reglează în mare măsură mielofibroza indusă de mutația JAK2V617F.

      Discuţie

      Au fost raportate mai multe modele pentru a explica mecanismul dezvoltării mielofibrozei. Pe baza analizelor efectului constitutiv al activării JAK-STAT in vivo, factorii derivați de megacariocite precum TGF-β1, PDGF și CXCL4 sunt identificați ca stimulatori esențiali pentru dezvoltarea anumitor celule mezenchimale precum Gli1 + și Lepr + celule stromale mielofibroză. 6,8,21,22 În contrast, unele rapoarte au sugerat că factorul cheie al mielofibrozei poate fi linia mieloidă care adăpostește mutații oncogene. Schepers și colab. Au raportat că, folosind un model de șoarece de leucemie mielogenă cronică, celulele mieloide de leucemie mielogenă cronică stimulează celulele stromale multipotente să supraproducă celule osteolineată modificate funcțional, ceea ce duce la fibroza măduvei. 23 Verstovsek și colab. Au arătat rolul direct al fibrocitelor neoplazice umane derivate din monocite într-un model de xenogrefă al PMF. 24 Deși mecanismele de realizare a mielofibrozei variază în funcție de modele, studiul nostru actual a introdus macrofagele ca o populație importantă de celule noi pentru a sprijini proliferarea și activarea miofibroblastelor in vivo.

      Megacariocitele nu sunt prezente în zona fibrotică în modelul nostru de bază al mielofibrozei (Figura 12C-D suplimentară), ceea ce sugerează că nu sunt suporteri critici pentru miofibroblaste, în funcție de model. În studiul nostru cu un model MPN bazat pe JAK2V617F, o puternică corelație pozitivă între expresia ARNm TGF-β1 și severitatea mielofibrozei a apărut numai în absența VDR în celulele hematopoietice. Mai mult, efectul ablației macrofagelor asupra prevenirii mielofibrozei a fost drastic, în ciuda nicio reducere a megacariocitelor. Acestea indică faptul că, în calitate de motor al miofibroblastelor, macrofagele sunt cel puțin la fel de importante ca megacariocitele. De asemenea, este posibil ca discuția încrucișată între megacariocite și macrofage să fie importantă pentru formarea mielofibrozei. Deoarece s-a raportat expresia VDR în megacariocite, 31 de vitamina D produsă de macrofage poate modula funcția megacariocitelor în MPN (o propunere în figura suplimentară 18).

      Am arătat în acest studiu că mielofibroza este o consecință a devierii progresive a comunicării interorganice între sistemele hematopoietice și scheletale. În clinică, dezvoltarea unor antagoniști VDR eficienți și/sau terapii antimacrofage poate fi strategii promițătoare pentru controlul pacienților cu MPN cu mielofibroză.

      Versiunea online a acestui articol conține un supliment de date.

      Costurile de publicare ale acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxei de pagină. Prin urmare, și numai pentru a indica acest fapt, acest articol este marcat prin prezenta prin „reclamă” în conformitate cu 18 USC secțiunea 1734.

      Mulțumiri

      Autorii îi mulțumesc lui Paul S. Frenette (Colegiul de Medicină Albert Einstein, New York) pentru comentariile utile asupra manuscrisului.

      Această lucrare a fost susținută de PRESTO, Agenția de Știință și Tehnologie din Japonia (# JPMJPR12M7 [Y. Katayama]), o subvenție CREST de la AMED (# JP18gm0910012h2 [Y. Katayama]) și Grant-in-Aid for Research Research de la Societatea japoneză pentru promovarea științei (# 15H04856, # 18H02837 [Y. Katayama]) și pentru cercetarea științifică în domeniile inovatoare de la Ministerul Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei din Japonia (# 25118715 [Y. Katayama]) . Această lucrare a fost, de asemenea, susținută de Fundația Daiichi Sankyo pentru Știința Vieții, Fundația Itochube, granturile de cercetare Novartis Pharma, Fundația Astellas pentru Cercetarea Tulburărilor Metabolice și Fundația de Cercetare Medicală SENSHIN (Y. Katayama).

      Autor

      Contribuție: K.W. a efectuat toate experimentele și a scris manuscrisul; K.M., Y. Kawano, H.K., T.S., S.I., A.S., N.A. și M.S. ajutat la întreținerea animalelor, pregătirea probelor de țesut și captarea imaginilor; S.K., K. Shide, K. Shimoda și T.M. a supravegheat studiile pentru șoarecii VDR -/- și JAK2V617F Tg; iar Y. Katayama a supravegheat toate experimentele și a scris manuscrisul.

      Dezvăluirea conflictului de interese: Autorii declară că nu există interese financiare concurente.